唾液胃蛋白酶对胃食管反流病食管外表现的诊断价值研究

游婷 王雯 王蓉 柳刚 林燕芳

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是消化系统常见的疾病之一，临床上可表现为典型的反流、烧心症状，同时也可表现为许多食管外症状，包括慢性咳嗽、咽喉部异物感、声音嘶哑等，该病在全世界均有较高的患病率。据报道，GERD在韩国、中国、欧洲的患病率分别为4.6%～10.7%、12.5%～12.7%、8.8%～25.9%，而其在北美地区的患病率甚至高达18.1%～27.8%［1-4］。据估计，至少有33%的GERD患者伴有食管外表现症状［5］。然而，目前对GERD食管外表现仍无准确的诊断方法。近年来，唾液胃蛋白酶检测技术作为一项快速、廉价、安全、有效的检测手段受到了关注，即PEP-TEST检测。但由于目前该项技术仍处于研究初期，尚无统一的诊断标准，许多数据仍待进一步试验证实。因此，本研究通过比较健康志愿者与GERD食管外表现患者之间的唾液胃蛋白酶浓度差异，评估其对GERD食管外表现的诊断价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年3月至2018年1月就诊于联勤保障部队第九〇〇医院消化内科确诊为GERD食管外表现的患者15例（唾液标本60份），定为GERD食管外表现组。其中，男性7例，女性8例，平均年龄（45.3±25.6）岁。对照组选健康志愿者15例（唾液标本60份），男性7例，女性8例，平均年龄（43.8±22.2）岁。两组年龄、性别差异无统计学意义。

二、纳入与排除标准

1.GERD食管外表现组纳入标准：（1）咽喉反流症状指数评分量表（reflux symptom index，RSI）≥13分或/且咽喉反流体征评分量表（reflux fineling score，RFS）≥7分，有或没有反流症状；（2）1周内未使用质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI），3 d内未使用H2受体抑制剂、促胃动力药物、抗酸药等；（3）24 h MII-pH确诊为GERD，并根据症状相关性分析，证实食管外症状系由GERD引起。

2.对照组纳入标准：（1）无明显反流、烧心、咽喉异物感等反流症状；（2）GERDQ＜8分且RSI＜13分且RFS＜7分；（3）24 h MII-pH排除GERD诊断的健康志愿者。

3.排除标准：（1）患有精神疾病、既往胃食管或咽喉手术史、怀孕和泌乳期间的患者；（2）确诊为食管癌、胃癌、咽喉癌等其他恶性肿瘤，或存在严重的消化道、呼吸道良性疾病（如严重溃疡、咽喉部息肉）；（3）所有应接受其他治疗且病情会对本研究影响的患者；（4）既往心脏等重要脏器疾病病史不耐受本研究的患者；（5）胃镜下见食管胃黏膜异位者；（6）无法行电子胃镜检查者。

表1 胃食管反流病量表（GerdQ）

表2 咽喉反流症状指数评分量表（RSI）

表3 咽喉反流体征评分量表（RFS）

二、研究方法

（一）问卷评分、PPI试验及24 h MII-pH检测

对纳入的研究对象分别行GerdQ评分、RSI评分、RFS评分及24 h MII-pH检测，根据结果对纳入对象进行筛查及分组。其中，对照组（C组）为GERD-Q＜8分且RSI＜13且RFS＜7，24 h MII-pH排除GERD诊断；GERD食管外表现组（E组）为RSI≥13分或/且RFS≥7分，且24 h MII-pH确诊为GERD，并根据症状相关性分析，证实食管外症状系由GERD引起。

（二）唾液胃蛋白酶检测方法

收集患者晨起空腹、午餐后2 h、晚餐后2 h及症状发生时的唾液。患者用10 ml装有0.5 ml的枸橼酸（0.1 mmol/L）痰杯，收集唾液标本。嘱其收集前先吐清口腔内唾液，用力深咳，并采集咽喉深部的唾液3～4 ml。轻轻震荡唾液标本1 min，并存放于4℃冰箱保存，次日冰袋低温储存送回标本。将收集的唾液标本在4℃下离心15 min，离心后取其上清液10 μl，使用人胃蛋白酶检测试剂盒进行酶联免疫吸附检测，后用读数仪读取结果。

三、统计学分析方法

使用SPSSI 20.0统计学软件进行数据处理。呈正态分布的计量资料以±s表示；非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组总体唾液胃蛋白酶浓度的比较

将C组唾液胃蛋白酶浓度与E组对比，结果发现E组的唾液胃蛋白酶浓度明显高于C组（P＜0.05，见表4）。

表4 两组间唾液胃蛋白酶浓度比较（±s，ng/ml）

表4 两组间唾液胃蛋白酶浓度比较（±s，ng/ml）

组别C组E组统计量/统计值P值例数15 15份数60 60唾液胃蛋白酶浓度63.59±14.34 128.98±17.28 0.000

二、两组间及组内不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度的比较

1.两组间唾液胃蛋白酶浓度的比较

对比两组间唾液胃蛋白酶浓度的差异，结果发现E组各时间点的唾液胃蛋白酶浓度均明显高于同一时间点C组的浓度（P＜0.05）。见表5。

2.组内不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度的比较

对比两组内不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度，结果发现C组组内不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。E组组内不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度比较差异显著（P＜0.05）。其中，午餐后2 h的唾液胃蛋白酶浓度最高。而E组其他各时间点之间唾液胃蛋白酶浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 两组不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度比较（±s，ng/ml）

表5 两组不同时间点的唾液胃蛋白酶浓度比较（±s，ng/ml）

注：与E组午餐后2 h之间的组内比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.01

症状时60.52±14.84 126.10±12.60*#0组别C组E组P值晨起空腹63.41±11.63 124.28±17.50*#0午餐后2 h 64.14±13.14 143.54±12.60#0晚餐后2 h 66.30±17.90 122.00±15.77*#0

讨 论

GERD已成为临床上常见的，甚至是危害极大的消化道慢性疾病。它的发生主要与食管括约肌松弛、抗反流防御功能降低、胃十二指肠内容物反流至食管甚至咽喉有关。临床上既可表现为典型的反流、烧心症状，也可表现为许多食管外症状，包括慢性咳嗽、咽喉部异物感、声音嘶哑等。近年来，随着人们对GERD食管外表现认识的加深，临床上相关的检测技术也在不断地发展。目前，食管外表现的GERD的检测仍以24 h MII-pH为“金标准”，但由于该项检测手段都存在一定的侵入性，且价格较昂贵，临床上的推广受到了限制。因此，快速、安全、方便的唾液胃蛋白酶检测技术逐渐引到了学者们的关注。

胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）主要是由泌酸腺的胃壁主细胞合成和分泌，是胃蛋白酶的无活性前体。应用电泳技术可分离出7种胃蛋白酶同工酶原，即PG1-7。而临床上我们将胃蛋白酶原主要分为胃蛋白酶原I（PGI/PGA）与胃蛋白酶原Ⅱ（PGII/PGC）。其中，PGI是由PG1-5组成，其主要是由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；而PGII是由PG6-7组成，它主要来源于全胃腺，占胃黏膜合成PG总量的25%，十二指肠上段的Brunner腺、前列腺和胰腺也产生少量PGIⅡ。PG大部分进入胃腔转化为有活性的胃蛋白酶，仅有1%PG通过胃黏膜毛细血管进入血液循环通过肾排出。

在胃酸的作用下或酸性环境中，PG分离出1个含有44位氨基酸的多肽后形成有活性的胃蛋白酶［6］。同时，PG也存在自我激活效应，即已被激活的胃蛋白酶对PG也有激活作用。胃蛋白酶只有在酸性环境中才能发挥作用，其最适pH值为1～2，在最适的温度和pH环境中胃蛋白酶可保持稳定状态达24小时以上，超过24小时在自催化作用下发生降解。

Bardhan指出应用高效阴离子交换色谱法（HPAEC）可将胃蛋白酶分为1、2、3、5亚型，胃蛋白酶3又可进一步分为3A、3B、3C，其中胃蛋白酶3B分子量最大、所占比重最大（70%）［7］。每种同工酶都有各自的最适pH值。Yufera等［8］运用血清放射性碘方法发现胃液胃蛋白酶在pH2.0环境中活性最大，在pH6.5时呈失活状态，但保持稳定，当pH再次下降时其活性可恢复。Johnston等［9］利用胃蛋白酶3B探究胃蛋白酶在咽喉反流模型中的活性及稳定性，结果发现胃蛋白酶在pH2.0时的活性最大；pH1.5时其可保持最大活性的80%；pH6.0时其保持最大活性的10%；pH≥6.5时其活性消失。在37℃、pH2.0～8.0溶液中胃蛋白酶可保持稳定状态达24小时以上，在pH6.8人咽喉部胃蛋白酶虽无活性但仍保持结构的完整性，当pH再次降至3.0时其活性可恢复68%～90%。

Hayat等［10］对 100例健康志愿者及 111例GERD患者晨起、午餐后1 h、晚餐后1 h的唾液胃蛋白酶进行检测，结果发现1/3健康志愿者唾液中可检测出低浓度胃蛋白酶，且GERD患者唾液中胃蛋白酶浓度明显高于对照组。Sereg-Bahar等［11］对比分析24例咽喉反流患者及48例健康志愿者的唾液胃蛋白酶浓度，结果发现咽喉反流组唾液胃蛋白酶浓度明显高于健康志愿者。本研究以24 h pHMII为金标准，同样也发现GERD食管外表现组的唾液胃蛋白酶浓度明显高于对照组，且进一步分析两组间不同时间点的唾液胃蛋白浓度，结果发现GERD食管外表现组不同时间点采集的唾液标本，其胃蛋白酶浓度均明显高于同一时间点的对照组。由此可见，由于健康人群中存在生理性反流现象，因此无论是健康人群还是GERD食管外表现人群，当反流发生时，胃腔内被激活的胃蛋白酶可随着胃十二指肠内容物反流至食管甚至咽喉，导致了健康人群及GERD食管外表现患者的唾液标本中均可检测到胃蛋白酶。但由于GERD食管外表现患者发生反流的次数较健康人群明显增多，反流持续时间明显延长，故GERD食管外表现患者的唾液胃蛋白酶浓度较健康人群明显升高，说明唾液胃蛋白酶可作为诊断GERD食管外表现的检测方法之一。

Hayat等［10］同时分析不同时间段唾液标本的胃蛋白酶差异，结果发现餐后的唾液标本其胃蛋白酶的阳性诊断率更高，且其浓度可明显高于晨起时。Du等［12］对比分析250例疑似GERD患者及35例健康志愿者晨起空腹、午餐后2 h、晚餐后2 h的唾液胃蛋白酶变化，该检测使用的是24 h pH-MII联合，结果发现GERD组唾液胃蛋白酶阳性率及浓度明显高于正常组，且餐后反流症状发生时的唾液胃蛋白酶对GERD的诊断率最高，而与本研究的结果不一致。与上述结果存在差异的原因可能与两研究中纳入的研究对象不同有关。本研究纳入的研究对象为经24 h MII-pH确诊的健康志愿者及GERD食管外表现患者，而上述研究中试验组纳入的研究对象为健康志愿者及疑似GERD患者，试验前未对研究对象进行明确诊断。为了进一步分析午餐后2 h的唾液胃蛋白酶浓度明显高于其余时间点的原因，笔者后期对纳入的研究对象进行了逐一的电话随访，绝大多数研究对象表示其于进食午餐后半小时内即行午睡休息，进食后平躺会明显增加胃内容物反流至咽喉部的概率。因此，推测GERD食管外表现组午餐后2 h的唾液胃蛋白酶浓度明显高于该组其他时间点的原因可能是本试验研究对象的生活及饮食习惯所致。其次，本研究的试验样本量较少，且纳入的研究对象较局限，均为经24 h MII-pH确诊的健康志愿者及GERD食管外表现患者。

综上所述，对于以食管外表现为主要症状的GERD患者而言，唾液胃蛋白酶检测技术可作为其诊断的一项重要方法。相较于目前临床上常见的反流检测技术而言，唾液胃蛋白酶检测技术不但方便、廉价，而且快速、安全，有临床推广价值。