葡萄柚提取物在牙膏中的应用研究

田 政 肖博文 张 环* 邓全富

(重庆登康口腔护理用品股份有限公司,重庆 400025)

前言

随着生活水平不断提高，人们越来越关注自己的口腔健康，对口腔卫生用品——牙膏的要求也越来越高，除单一清洁功能外，还需要具有护龈、抑菌、美白、抗敏等附加功能。牙龈炎是发生在牙龈组织的细菌感染性疾病，表现为牙龈出血、红肿、胀痛，变异链球菌、具核梭杆菌等是牙龈炎的主要致病菌[1-3]。我国有超过百分之八十的成年人出现了不同程度的牙龈问题，使用抑菌剂抑制口腔有害细菌的生长，是维护口腔健康的重要环节，目前，寻找天然、有效的植物抑菌剂成为研究热点，采用有抑菌功效的天然提取物来制备牙膏，赋予牙膏抑菌护龈功效，将备受消费者青睐[4,5]。

葡萄柚提取物是一种天然提取物，是一种广谱抑菌类化合物，高效且很有发展潜力，杀菌在非常低的浓度时就可取得显著的效果。柚皮苷是葡萄柚果提取物的活性成分之一，具有多种生物活性，如抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抑菌、改善微循环等，在医药、食品等领域有广泛应用[6,7]。本研究对葡萄柚提取物中柚皮苷的变异链球菌和具核梭杆菌最小抑菌浓度MIC值进行测定，并根据最小抑菌浓度计算出牙膏中的添加量，考察了牙膏的稳定性，及其牙膏中柚皮苷含量，为含葡萄柚提取物的抑菌护龈牙膏制备提供理论支持和试验依据。

1 试验部分

1.1 试验材料

葡萄柚提取物：浅黄色澄清液体，柚皮苷含量为7.68mg/ml菌种：变异链球菌ATCC 25175，具核梭杆菌 ATCC 25586

培养基：双倍TPY培养基，胰蛋白胨30g、酵母提取物8g、葡萄糖20g、12g KH2PO4、4g K2HPO4·3H2O、4g Na2CO3、4g NaCl，加水至 1000 mL，pH =7.0 ，灭菌备用，对应双倍固体培养基只需在其中加入 24g 的琼脂。双倍牛心浸液琼脂培养基，称取市售BHI琼脂粉74g，加水至1000 mL，充分溶解，121℃灭菌15min, 4℃冰箱保存，使用时将其融化后冷却至50℃左右，加入5%～10%脱脂纤维绵羊血，混匀后倾注于平板上。

液体石蜡

真空制膏机及牙膏用原料

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄柚提取物MIC值测定方法

1.2.1.1 制备菌悬液

将菌种进行活化培养48小时后，配制成细菌浓度为 106CFU/mL 的供试菌悬液。

1.2.1.2 比浊法测定最小抑菌浓度

(1) 配制好液态培养基，反复过滤，然后按照以下方法稀释测试样品：

实验组：每批取8支大小相同的灭菌小试管，向8支管内分别加入5ml灭菌液态培养基，在第一管内加入4mL葡萄柚提取物样品和1mL的含0.5%吐温 80的0.9%的无菌生理盐水，用涡旋仪混匀，配成柚皮苷浓度为 3.07 mg/mL 的含样品培养基，然后吸取5mL到第二管，再从第二管吸取5mL到第三管，依次类推进行二倍稀释，最后一支管吸取5mL弃去。最终得到柚皮苷浓度分别为：(3.07、1.54、0.77、0.38、0.19、0.096、0.048、0.024mg/mL)。

对照组(0.6%山梨酸钾)：取一支相同的试管，加入5mL培养基，再加入 5mL 含 0.5%吐温80的0.9%的无菌生理盐水，最后加入0.06g山梨酸钾。充分混匀后，吸取5mL弃去。

空白组：取一支相同的试管，加入5mL培养基，再加入5mL含0.5%吐温80的 0.9%的无菌生理盐水，充分混匀后，吸取5mL弃去。

(2)准确吸取 106CFU/mL 的菌悬液 40uL，加入到系列浓度的各样品试管中，混匀，在具核梭杆菌中加入液体石蜡封口。置于厌氧罐中 37 ℃下培养 24h-48h，并与现制备的未经培养的含菌试管作对照，观察生长状况。

(3)吸取10ml以上含菌悬液的样品管和对照管于平皿中,加入10mL双倍BHI琼脂培养基和5%-10%的脱脂纤维绵羊血，充分混匀，37℃于厌氧罐中培养48h，菌落生长完全被抑制的最低浓度则为该样品的MIC。

1.2.2 含葡萄柚提取物的牙膏稳定性测定

选择一个比较有代表性的基础配方(见表1)，加入一定量的葡萄柚果提取物进行牙膏稳定性研究。

表1 牙膏配方

(1)稳定性测试依据 GB/T 8372-2017《牙膏》进行室温3个月和45℃加速老化3个月测试(模拟室温3年，3年为市面牙膏常规保质期)。

(2)牙膏中柚皮苷含量测定参照《口腔清洁护理用品 牙膏中柚皮苷含量的测定 高效液相色谱法(报批稿)》。

2 结果与讨论

2.1 葡萄柚提取物的MIC值

通过比浊法测定葡萄柚提取物的最小抑菌浓度，测试结果见表2。测试结果显示，葡萄柚提取物中柚皮苷对变异链球菌和具核梭杆菌这两种口腔细菌种都有较好的抑制作用，其对变异链球菌和具核梭杆菌的 MIC 值均为 0.048mg/mL，与文献值[8](0.04688 mg/mL)基本吻合。

表2 葡萄柚提取物的MIC值

2.2含葡萄柚提取物的牙膏稳定性

根据抑菌测试结果，可推算出葡萄柚提取物(柚皮苷含量为7.68mg/ml)在牙膏中的添加量应不低于0.65%时，柚皮苷含量可达到该葡萄柚提取物的MIC值,起到抑制变异链球菌和具核梭杆菌的效果。为验证葡萄柚提取物加入到牙膏中对膏体稳定性的影响，选择一个比较有代表性的基础配方进行研究，添加葡萄柚果提取物百分比含量分别为0.65%、0.75%、1%，放于室温和45℃烘箱进行跟踪测试，观察样品的感官指标、理化指标、卫生指标、柚皮苷含量等，结果见表3、表4。

表3 含葡萄柚提取物牙膏的稳定性测试数据

表4 牙膏中柚皮苷含量测定数据

由表3可以看出，含葡萄柚提取物的牙膏配方1、配方2、配方3稳定性满足《牙膏(GB/T 8372-2017)》标准的要求，膏体细腻、均匀，在三个月加速老化试验过程中，pH无显著性变化，稳定性好，膏体无变色、分水、分油异常现象，通过三个月稳定性试验。由表4可以看出，牙膏中柚皮苷含量参照《口腔清洁护理用品 牙膏中柚皮苷含量的测定 高效液相色谱法(报批稿)》测定时，配方1、配方2、配方3的柚皮苷含量均可检出，3个月室温试验，柚皮苷含量基本稳定，3个月加速老化试验，柚皮苷含量略有下降，为保证牙膏中45℃加速老化试验后牙膏的柚皮苷含量高于葡萄柚果提取物的最小抑菌浓度0.048mg/ml,建议牙膏中葡萄柚果提取物(柚皮苷含量为7.68mg/ml)的添加量不低于0.75%。

3 结论

①葡萄柚提取物对变异链球菌和具核梭杆菌这两种口腔细菌种都有较好的抑制作用，其对变异链球菌和具核梭杆菌的 MIC 值均为 0.048mg/mL。

②牙膏中葡萄柚提取物的添加量为0.65%～1%时，牙膏稳定性好，通过三个月45℃加速老化稳定性测试，但牙膏的柚皮苷含量在加速老化实验中略有下降，为保证牙膏在3年保质期内柚皮苷含量高于0.048mg/ml,建议牙膏中葡萄柚果提取物(柚皮苷含量7.68mg/ml)的添加量不低于0.75%。