富含血小板血浆修复小鼠皮肤组织缺损创面的实验研究

刘思婧，张潇，李益，罗茂，吴剑波，李蓉△

皮肤是人体内外环境的屏障，大面积烧伤、创伤、肿瘤切除手术等均会导致皮肤及其软组织缺损，目前针对皮肤损伤的治疗方法主要是皮肤移植，但是对于大面积皮肤缺损的患者，由于其自身皮源不足，使得创面治疗非常困难［1］。富含血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是静脉血经2 次梯度离心得到的血小板浓缩物［2］，其可在CaCl2、凝血酶等激活剂作用下形成凝胶，释放多种高浓度促进组织再生修复的生长因子。因PRP 来源于自体，可刺激组织再生和早期愈合，不会致畸和诱发肿瘤［3］。本研究旨在通过建立小鼠皮肤创伤模型，观察PRP 不同处理方式对皮肤创伤愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 清洁级健康雄性C57BL/6J 小鼠27 只，10周龄，体质量（27.48±1.20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（第一批购买15 只，第二批购买12 只）。所有小鼠饲养条件为昼夜各12 h 循环照明，温度（22±3）℃，湿度（34±5）%，自由摄食和饮水。实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）逆转录试剂盒购自日本TaKaRa 株式会社，Ⅰ型胶原α1 链（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1）、Ⅲ型胶原α1 链（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PCR引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司，凝血酶购自Sigma 公司（美国），Ⅰ型胶原免疫荧光抗体（abcam，ab34710），Ⅲ型胶原免疫荧光抗体（abcam，ab7778），羊抗兔IgG二抗购自艾博抗（上海）贸易有限公司，无水CaCl2购自国药集团化学试剂有限公司。低温高速离心机（德国Thermo公司），荧光定量PCR 仪（美国BioRad 公司），荧光倒置相差显微镜（美国AMG公司），莱卡显微镜。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 取15只小鼠，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部脱毛，脱毛完成后俯卧位固定在手术操作台上，将剔除毛发的背部皮肤用乙醇消毒后，再用生理盐水对背部皮肤进行擦拭，提拉皮肤中线，用直径为5 mm的小圆刀切除全层皮肤至肌层表面，形成皮肤软组织缺损创面。随后将15只小鼠根据随机数字表法分为3组，每组5只，依次为：（1）对照组。在圆形创缘按等距的6点皮下注射生理盐水，每个注射点中注入0.1 mL，每只共计注射0.6 mL。（2）PRP 注射组。在圆形创缘按等距的6 点进行皮下注射PRP，每个注射点中注入0.1 mL，每只共计注射0.6 mL。（3）PRP 凝胶组。每只准备0.6 mL PRP，激活成凝胶覆盖于创面。术后使用棉签止血及油性纱布包扎，将各组小鼠单笼饲养，3 d后去除创面油性纱布，且未再给予药物。

1.2.2 PRP凝胶的制备 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉剩余的12只小鼠，用预先装有0.1 mL ACD-A抗凝剂的1 mL注射器经腹腔静脉取血后，立即注入1.5 mL EP 管中，暂存于4 ℃的冰箱中。待所有小鼠采血完成后，置于低温离心机中离心（4 ℃，100×g，10 min），此时血样分为3层，上层为淡黄色上清液，中间为白细胞层，下层为红细胞。小心吸取上层清液及中间层白细胞于新的EP 管中，再次置于低温离心机中离心（4 ℃，1 600×g，10 min），吸走上层清液的3/4，轻轻混悬，即得到PRP。用血球计数板计数获取的PRP 中的血小板浓度为5 500×109个/L，为全血的5倍，说明PRP制备成功。将得到的PRP 与激活剂（凝血酶与10%CaCl2的混合物）以9∶1 比例混合，常温振荡，5 min后即形成PRP凝胶。

1.2.3 创面形态观察与测量 在术后当天及术后第3、7、11、14 天进行拍照，观察伤口周围的炎症反应、液体渗出以及伤口愈合情况；使用Image J 软件，设定好标尺，在需要测量的创面上进行伤口边缘勾画，每只小鼠测量5次，求平均值计算伤口面积。

1.2.4 免疫荧光染色 小鼠术后第14天处死，取伤口处皮肤制成病理切片，经过脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复、内源性过氧化氢酶消除、血清封闭后，切片用Ⅰ型胶原蛋白（1∶50）、Ⅲ型胶原蛋白（1∶50）抗体4 ℃过夜孵育，然后滴加羊抗兔IgG二抗，根据DAPI染色程度判定胶原蛋白的表达情况。

1.2.5 伤口处皮肤组织COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF、VEGF mRNA水平测定 取伤口处皮肤组织，采用Trizol法提取伤口处皮肤组织总RNA，反转录试剂盒反转录成cDNA。反转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。按照 qRTPCR 反应体系配置好后进行扩增，扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，50～60 ℃退火10 s，共39 个循环。引物序列见表1。根据得出的荧光曲线的Ct 值，以β-actin 为内参，2-ΔΔCt法计算结果。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR所用引物序列

1.3 统计学方法 应用Graphpad prism 7.0统计软件分析处理，结果以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用Tukey法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRP 凝胶对小鼠皮肤伤口闭合的影响 术后第3 天，PRP 凝胶组较另外2 组皮肤创面渗出液减少，伤口周围干燥，且红色肉芽组织开始生长，伤口周围上皮开始收缩。术后第11、14 天，PRP 凝胶组的皮肤伤口明显愈合，见图1。在术后各时间点，与对照组和PRP 注射组相比，PRP 凝胶组伤口面积减小（P＜0.05），术后第11、14 天，与对照组相比，PRP注射组伤口面积减小（P＜0.05），见表2。

2.2 PRP 凝胶对胶原蛋白表达的影响 各组小鼠皮肤组织中Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白均阳性表达。与对照组和PRP 注射组相比，PRP 凝胶组2 种胶原蛋白表达明显增加，见图2、3。

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3组小鼠皮肤损伤后不同时间点伤口面积比较（n=5，cm2，）

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3组小鼠皮肤损伤后不同时间点伤口面积比较（n=5，cm2，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与PRP注射组比较，P＜0.05

组别对照组PRP注射组PRP凝胶组F第3天0.22±0.01 0.21±0.01 0.14±0.01ab 267.200＊＊第7天0.20±0.01 0.19±0.01 0.10±0.01ab 432.900＊＊第11天0.18±0.01 0.15±0.01a 0.03±0.01ab 958.100＊＊第14天0.08±0.01 0.05±0.01a 0.02±0.01ab 119.900＊＊

2.3 小鼠皮肤伤口组织相关基因mRNA 表达水平比较 与对照组和PRP 注射组相比，PRP 凝胶组VEGF、COL1A1、COL3A1、TGF- β1 和 PDGF 的mRNA 表达水平均升高（P＜0.05）；与对照组相比，PRP 注射组 COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF 的mRNA 表达水平均升高（P＜0.05），VEGF mRNA 表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

皮肤缺损的修复过程是一个复杂、动态且有序的生物学过程，它包括起始的炎症阶段、肉芽组织增生、组织的重塑改建，这几个阶段相互关联和相互影响［4］。在许多疾病中，一种或几种机制受损可以导致愈合过程失败，从而造成伤口难以愈合［5］，而伤口愈合延迟通常会导致局部感染加重［6］。

PRP 中血小板 α 颗粒含 PDGF、VEGF 等大量生长因子，它们在血管新生以及促进细胞增殖等创伤组织进行修复的环节发挥重要作用［7］。只有当PRP被外源物激活以后，血小板α 颗粒中的各种生长因子才会大量释放，最终为细胞的黏附提供有利条件，从而上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量［8］。PRP 凝胶相当于给血小板穿上了保护衣，可保护血小板在体外不受损害，防止血小板的流失，使血小板在局部可以长时间停留，分泌高浓度生长因子，并且PRP凝胶还有一定的可塑性［9］。本研究结果表明，在小鼠的背部皮肤伤口给予PRP 凝胶可以明显上调COL1A1、COL3A1 的 mRNA 表达，通过后续的免疫荧光结果也验证了激活PRP可以有效促进胶原蛋白在伤口部位的合成。而未激活的PRP混悬液经皮下注射后，对伤口愈合有一定促进作用，但与激活PRP的作用比较，对伤口愈合作用的能力较弱。这也与PRP 激活后释放大量活性因子的结果相一致。因此，笔者推测PRP 凝胶可能通过促进胶原蛋白大量合成来加速伤口愈合。

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3组小鼠皮肤伤口相关基因水平的比较（n=5，）

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3组小鼠皮肤伤口相关基因水平的比较（n=5，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与PRP注射组比较，P＜0.05

组别对照组PRP注射组PRP凝胶组F VEGF 1.00±0.32 1.30±0.38 6.47±0.61ab 229.200＊＊COL1A1 1.00±0.20 3.62±0.65a 6.28±0.97ab 74.490＊＊组别对照组PRP注射组PRP凝胶组F COL3A1 1.00±0.02 1.98±0.25a 7.30±0.51ab 537.700＊＊TGF-β1 1.00±0.19 3.54±0.33a 9.83±0.88ab 337.100＊＊PDGF 1.00±0.60 3.74±0.63a 7.97±0.95ab 111.500＊＊

在皮肤伤口愈合过程中，血管化发挥着重要作用［10］，血管生成对于滋养新形成的肉芽组织和角质细胞至关重要［11］。本研究发现，给予小鼠皮肤伤口PRP凝胶可以诱导创伤组织中多种血管生成因子如TGF-β1、VEGF、PDGF mRNA 水平明显升高。而PRP 注射组VEGF mRNA 表达水平与对照组比较差异无统计学意义，且PRP注射组伤口面积在第11天才有明显的减小。因此，笔者推测PRP 凝胶可能通过促进血管生成来加速伤口愈合。

目前，临床多使用单一生长因子，仅能促进某一阶段的创面愈合过程。已有研究证实，将多种生长因子组合使用，更符合创伤愈合的生物学过程，达到最佳的促进创面愈合效果［12］。血小板激活后，可持续释放多种与机体内配比、种类类似的生长因子［13］。本研究通过离心法成功制备PRP后混合加入适量的凝血酶和钙离子，促使PRP 形成凝胶状，即PRP 凝胶。与临床上应用的单一生长因子相比，PRP 凝胶有其独特的优势，其可为创面提供一个适合愈合的湿润环境，还能在创面愈合阶段持续分泌高浓度生长因子，发挥最大的促愈作用［14］。此外，PRP凝胶是由大量的纤维蛋白组成的立体网状结构，可为细胞生长提供良好支架，同时纤维蛋白的回缩作用还可以促进创面收缩和凝血［15］。PRP凝胶可以是自源性的，避免了异种生长因子可能引起的免疫排斥。近年来国外已有相关报道将其成功应用于牙周病、口腔种植、颅面、骨关节软骨等修复［16-17］，但应用到皮肤创伤修复还并不成熟。本研究显示，对照组伤口愈合速度最慢，愈合时间也最长；PRP注射组愈合程度较对照组好；PRP凝胶组愈合程度最好，这证明了PRP制备为凝胶后可以促进创面的修复。经过PRP凝胶处理创面后，胶原蛋白大量生成，新生血管较多，瘢痕组织生成少，这些与PRP凝胶促愈作用以及能够持续提供高浓度、与体内配比相似的生长因子均有关。但本研究没有涉及不同浓度的PRP被激活以及PRP激活后释放的生长因子不同浓度配比对于皮肤伤口愈合的影响，有待更深入的研究。

综上所述，使用PRP 凝胶可以显著促进伤口处胶原合成及新血管生成。同时，它可以为局部组织持续提供大量生长因子，缩短创面愈合的时间。因此，PRP 凝胶有可能作为临床治疗皮肤创伤的一种有效手段。