益气活血方治疗心力衰竭的内质网应激机制研究

张婷 王婕 吴爱明 马喆 赵一舟 张冬梅 金秋硕 娄利霞

[摘要] 目的 探討益气活血方通过调节内质网应激（ERS）信号通路改善心力衰竭的分子机制。 方法 SPF级雄性SD大鼠30只，根据随机数字表法分为假手术组（10只），只开胸不结扎;余20只采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备大鼠急性心肌梗死模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、益气活血组，每组10只。模型组和假手术组灌胃去离子水5 mL/（kg·d），1次/d。益气活血组灌胃益气活血方5 mL/（kg·d），连续给药4周。左心室插管检测血流动力学指标包括左心室舒张终末压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dt max）、左心室内压最大下降速率（-dp/dt max）、左心室收缩压（LVSP）和心率（HR）。Rt-PCR法检测脑钠肽（BNP）、钙调神经磷酸酶A（CaNA）基因的表达水平，Western blot法检测caspase-12、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）蛋白的表达水平。 结果 模型组大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR高于假手术组;+dp/dt max、LVSP低于假手术组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。益气活血组大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR低于模型组;LVSP、+dp/dt max高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组大鼠BNP、CaNA mRNA表达高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。益气活血组大鼠BNP、CaNA mRNA表达低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表达水平高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）;益气活血组大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 益气活血方可以改善心肌梗死后大鼠的心功能，其机制与调节ERS信号通路有关。

[关键词] 益气活血方;内质网应激;心力衰竭;心功能

[中图分类号] R541.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（a）-0032-06

Study on endoplasmic reticulum stress mechanism of treating heart failure with Yiqi Huoxue Recipe

ZHANG Ting1   WANG Jie2   WU Aiming1   MA Zhe1   ZHAO Yizhou1   ZHANG Dongmei1   JIN Qiushuo1   LOU Lixia1

1.Chinese Internal Medicine Laboratory of of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100700， China; 2.Department of Cardiology， the First People′s Hospital of Lanzhou New District， Gansu Province， Lanzhou   730300， China

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanism of improvement effect of Yiqi Huoxue Recipe in heart failure treatment by regulating endoplasmic reticulum stress signaling （ERS） pathway. Methods Thirty SPF male SD rats were divided into sham operation group （10 rats） by the random number table method， and the remaining 20 rats model of acute myocardial infarction was prepared by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. Rats with successful modeling were randomly divided into model group and Yiqi Huoxue group，  with 10 rats in each group. The rats in model group and sham operation group were gavaged with deionized water 5 mL/（kg·d）， 1 time/d. Rats in Yiqi Huoxue group were gavaged with Yiqi Huoxue Recipe 5 mL/（kg·d）. The drug was administered continuously for 4 weeks. Hemodynamic index including left ventricular end-diastolic pressure （LVEDP）， left ventricular internal pressure maximal rate of increase （+dp/dt max）， left heart maximum drop rate of indoor pressure （-dp/dt max）， left ventricular systolic pressure （LVSP） and heart rate （HR） were detected by left ventricular intubation method. The expressions of brain natriuretic peptide （BNP） and calcineurin A （CaNA） mRNA were detected by Rt-PCR and the protein levels of caspase-12， protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase （PERK）， inositol requiring enzymes 1（IRE1） and glucose-regulated protein 78 （GRP78） were detected by Western blot. Results LVEDP， -dp/dt max and HR in model group were higher than those in sham group， +dp/dt max and LVSP were significantly lower than those in sham operation group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. LVEDP， -dp/dt max and HR of rats in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， LVSP and +dp/dt max were higher than those in model group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expressions of BNP and CaNA mRNA in model group were higher than those in sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The expressions of BNP and CaNA mRNA in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， with statistically significant differences （P < 0.05）. The expression levels of caspase-12， PERK， IRE1 and GRP78 in model group were higher than those in sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05）. The expression levels of caspase-12， PERK and IRE1 in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Yiqi Huoxue Recipe can improve the cardiac function of rats with heart failure induced by myocardial infarction， and the mechanism included may be related to the endoplasmic reticulum stress signaling pathway regulation.

[Key words] Yiqi Huoxue Recipe; Endoplasmic reticulum stress; Heart failure; Cardiac function

心力衰竭（heart failure，HF）是指由于各种原因的初始心肌损伤导致心脏结构和功能发生变化，造成心室充盈或射血功能受损，器官、组织血液灌注不足，引发肺循环和/或体循环瘀血的复杂临床综合征，严重危害人类的生命健康[1]。近年来，我国心力衰竭的患病率持续增加，病死率居高不下[2]，临床治疗面临严峻挑战。中医学认为，心力衰竭属于“胸痹”“真心痛”范畴，其病理性质为本虚标实之证，即气虚阳虚为本，痰淤水泛为标。已有研究[3]显示，气虚血瘀是心力衰竭的基本病理环节，因此补益心气需贯穿心力衰竭治疗的始终，同时采用活血化瘀疗法达到标本兼治的功效。

益气活血方具有益气温阳，活血通脉的作用，多年来在临床上用于治疗心力衰竭，可有效防止及缓解心力衰竭的病情进展[4-7]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指由于某种原因导致细胞内质网内稳态失衡、生理功能发生紊乱的一种亚细胞器的病理过程[8]。研究[9]显示，ERS与心力衰竭的病理生理过程密切相关，适度ERS是细胞的一种自我保护，但当ERS持续、过度发生时，会使心肌由代偿转为衰竭，参与心力衰竭的发生发展。本研究通过结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，同时给予益气活血方进行干预治疗，观察益气活血方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能的改善作用以及对ERS通路蛋白如caspase-12、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达的影响，拟探讨益气活血方治疗心力衰竭的ERS分子机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠30只，6周龄，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：scxk（京）2012-0001，动物合格证号：11400700212863。饲养条件：动物饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室（以下简称“本实验室”）SPF级实验动物房，室温：25℃±2℃，相对湿度：50%±10%，光照时间：白昼12 h，黑夜12 h，相关动物实验操作按照本实验室实验动物操作规程进行，符合动物伦理审查要求。

1.2 主要仪器与试剂

益气活血方由黄芪40 g、党参40 g、丹参20 g、川芎20 g、赤芍20 g、红花20 g组成，所有饮片均购自北京中医药大学东直门医院，由本实验室水煎浓缩制备，分装4℃保存;caspase-12一抗（ab62484）、IRE1一抗（ab48187）、GRP78一抗（ab21685）和GAPDH一抗（ab181602）购自美国abcam公司;PERK一抗（T980）购自美国Cell Signaling Technology公司;Trizol（1559 6026）购自美国Ambion 公司;反转录试剂盒（K1622）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司;SYBR Green PCR Master Mix购自美国ABI公司;所用引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成;全蛋白提取试剂盒（KGP250）购自江苏凯基技术生物有限公司，其余试剂为市售分析纯。

ALC-V8动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）;心电图机（厦门锡尔摩电气有限公司，FX-7402 Cardimax）;生物机能实验信号采集系统（成都泰盟软件有限公司，BL-420S）;千分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司，JA1003N）;4℃离心机（上海沪粤明科学仪器有限公司，TGL-16G）;Gene Quant紫外分光光度计（Pharmacia Biotech公司）;基因扩增仪GeneAmp PCR System 9700（美国ABI公司）;实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦科技公司，Mx3000P）。

1.3 实验分组与方法

1.3.1 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型制备  根据随机数字表法将大鼠分为假手术组（10只），余20只采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备大鼠心肌梗死模型[10]。1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉后，大鼠呈仰卧位，头颈部四肢自然伸直用橡皮筋固定于鼠板，手术区备皮消毒后，记录术前心电图。实施经喉气管插管并连接呼吸机，以80次/min、潮气量0.7～0.8 mL进行人工呼吸。左胸前区用络合碘消毒，75%酒精脱碘，左侧第3、4肋处横向切开皮肤约1.5 cm，后钝性分离局部肌层，沿第3、4肋间间隙打开胸腔，开胸器扩大手术视野，缓慢撕开心包，眼科弯镊慢慢提起左心耳，充分暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间向下约1 mm处用5/0线结扎左冠状动脉，此时肉眼可见结扎局部及左心室前壁心肌组织缺血呈灰白色，心脏搏动减弱，然后止血、清理胸腔，确定心电图显示ST段显著抬高后，還原心脏位置，分层缝合胸壁、肌层和皮肤，待大鼠状态平稳后，停止人工呼吸，同时记录术后心电图。术后即刻心电图显示ST段抬高、术后24 h心电图出现病理性Q波，提示结扎手术成功。术后连续3 d注射青霉素80万U/d预防感染。假手术组手术过程同上，但只穿线不结扎，术后常规饲养并分组给药4周。

1.3.2 动物分组及给药  大鼠心肌梗死术后24 h心电图检查评价模型制备情况，将造模成功的大鼠随机分为模型组和益气活血组，每组10只。模型组和假手术组灌胃去离子水5 mL/（kg·d），1次/d。益气活血组灌胃益气活血方5 mL/（kg·d），相当于生药量15 g/（kg·d）[11]，于造模后24 h开始给药，连续给药4周。

1.4 观察指标

1.4.1 血流动力学检测  大鼠经1%戊巴比妥钠（5 mL/kg）腹腔注射，麻醉后仰卧，橡皮筋固定于鼠板，络合碘消毒颈部正中皮肤后用酒精脱碘，钝性分离颈前肌群并暴露右颈总动脉，虹膜剪横向剪开动脉约1 mm，将导管插管（经肝素冲灌）插入左心室，等待大鼠稳定3～5 min后开始生物机能实验信号采集系统（成都泰盟软件有限公司，BL-420S）检测。检测指标主要包括：心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张终末压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dt max）、左心室内压最大下降速率（-dp/dt max）。

1.4.2 Rt-PCR法检测心力衰竭大鼠心肌组织钙调神经磷酸酶A（CaNA）、脑钠肽（BNP）基因在mRNA水平的表达  剪取心力衰竭大鼠心肌梗死边缘区组织，冰上匀浆后，用Trizol法提取总RNA，核酸紫外分光光度计测定光密度（OD）260/280，并计算总RNA浓度及纯度;逆转录2 μg总RNA，根据说明书配制20 μL反应体系，最终得到cDNA链，反转录条件：42℃ 60 min、70℃ 5 min。以cDNA为模板，采用Rt-PCR法检测目的基因BNP和CaNA的相对表达量，扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40次循环。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因，按照2-△△Ct法计算基因相对表達量。引物序列见表1。

1.4.3 Western blot法检测心力衰竭大鼠心肌组织caspase-12、PERK、IRE1、GRP78蛋白的表达  心力衰竭大鼠心肌组织进行蛋白提取、BCA蛋白定量，根据所提取蛋白样品的浓度，加入适量的裂解液和4X蛋白质上样缓冲液，最终将蛋白浓度稀释为5 mg/mL，分装冻存于-80℃冰箱备用;配制10%聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白样品煮沸10 min后，各样品每孔按照50 μg等量蛋白上样开始电泳，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时，将蛋白转膜至NC膜，5%脱脂奶粉室温敷育封闭1 h，加一抗caspase-12（1∶1000）、PERK（1∶500）、IRE1（1∶1000）、GRP78（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000），4℃冰箱孵育过夜，加相对应的特异性标记二抗（1：5000），室温孵育1 h后，ECL超敏发光液显色，使用Tanon 4600凝胶成像仪（北京原平皓生物技术有限公司）进行图像扫描，Image J软件进行条带灰度值分析，GAPDH作为内参。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验或者SNK检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血大鼠流动力学指标比较

模型组大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR高于假手术组;+dp/dt max、LVSP低于假手术组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。益气活血组大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR低于模型组;LVSP、+dp/dt max高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.2 三组大鼠心肌组织BNP、CaNA mRNA表达比较

模型组大鼠心肌组织BNP、CaNA mRNA表达高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。益气活血组大鼠心肌组织BNP、CaNA mRNA表达低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.3 三组大鼠心肌组织蛋白表达水平比较

模型组大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表达水平高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）;益气活血组大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05），益气活血组大鼠GRP78蛋白表达水平与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2～3。

PERK：蛋白激酶R样内质网激酶;IRE1：肌醇需要酶1;GRP78：葡萄糖调节蛋白78;GAPDH：磷酸甘油醛脱氨酶

3 讨论

在中医看来，气虚血瘀是慢性心力衰竭发生、发展的关键病机，贯穿整个病理过程，因此，临床使用益气活血法治疗慢性心力衰竭常可取得显著效果。本研究结果显示，模型组大鼠心功能减退;而益气活血组大鼠心功能明显提高。提示益气活血法可以改善心力衰竭，与临床报道益气活血法有效改善心功能[12]、提高患者的生活质量一致[13]。

BNP水平是心力衰竭的标志物，用于心力衰竭的诊断、病情评估、危险度分层，指导治疗与判定预后[14-16]。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织BNP、CaNA mRNA表达高于假手术组;益气活血组大鼠心肌组织BNP、CaNA mRNA表达低于模型组（P < 0.05），提示益气活血方可以有效纠正心力衰竭指标。已有临床研究[17]显示，益气活血方与西药联合治疗慢性心力衰竭，可以降低血浆BNP水平，提高患者临床效果，降低再住院率[18]。CaNA是唯一受钙离子和钙调素调节的丝氨酸蛋白质磷酸酶，其可以通过介导心肌损伤促进心肌细胞凋亡，参与心力衰竭的发生发展[19]。而本研究结果提示益气活血方能够降低心力衰竭大鼠心肌组织中CaNA mRNA含量，改善心力衰竭。

研究[14，20]显示，ERS信号通路是心力衰竭发生发展的重要分子机制。当ERS发生时，PERK、IRE1、GRP78解离并活化，上调ERS的相关基因表达，介导心力衰竭的发生发展[21]。而IRE1通路的长时间激活也能够通过激活caspase-12诱导心肌细胞凋亡[22]，引发或加重心力衰竭。本研究结果显示，模型组大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表达水平高于假手术组（P < 0.05），在心力衰竭过程中ERS通过促进应激分子GRP78同内质网相应跨膜蛋白解离，激活IRE1和PERK-eIF2a途径，触发JNKs、CHOP、caspase-12 通路，促使心肌细胞凋亡，最终导致心力衰竭[23]。益气活血组大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表达水平低于模型组（P < 0.05），提示益气活血方可能通过抑制ERS和未折叠蛋白反应的信号通路蛋白的表达水平，减轻ERS通路介导的心肌损伤，从而改善心力衰竭。

综上所述，益气活血方可能通过调节ERS通路蛋白分子表达改善细胞损伤，减轻心力衰竭程度。本研究有助于从分子水平理解和阐释益气活血方治疗心力衰竭的作用机制，为今后心力衰竭的中医药临床治疗机制研究提供新的方向和思路。

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（收稿日期：2019-09-29  本文编辑：刘明玉）