263例结核病并发HIV感染成年患者MTB耐药及耐药基因突变检测结果分析

傅小燕 黄涛 陈晴 何畏 黄晓秋 吴桂辉

据WHO[1]《2019年全球结核病报告》估算，2018年全球结核病新发患者例数为1000万例，其中HIV阳性者86万例，约占9%；在并发HIV感染者中，25万例死于结核病。而我国作为全球30个结核病及结核病并发艾滋病的高负担国家之一，形势不容乐观。据WHO[1]估计，2018年我国新增86.6万例结核病患者，发病率为61/10万；结核病并发艾滋病新增18 000例，其中死亡2400例。

文献研究提示，与HIV阴性者相比，HIV阳性者患耐多药结核病的风险更高[2-3]，据WHO[4]第四次双感患者耐药监测统计结果提示，全球范围内HIV阳性的结核病患者耐药率为20%。我国结核病并发HIV感染患者的耐药疫情亦十分严峻，相关研究提示，我国结核病并发HIV感染患者总体耐药率为20%～45%，且存在地区差异性[5-6]。本研究回顾性分析2017年7月至2019年6月成都市公共卫生临床医疗中心结核科收治入院的结核病并发HIV感染的316例患者的结核分枝杆菌耐药谱分布及耐药基因突变特征，为临床制订合理的化疗及患者耐药管理方案提供参考。

资料和方法

一、研究对象

收集2017年7月1日至2019年6月30日成都市公共卫生临床医疗中心收治入院、经BACTEC MGIT 960 分枝杆菌培养并鉴定为结核分枝杆菌，同时并发HIV感染的患者，共计316例；排除微孔板药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果数据及资料不全者53例，最终纳入263例患者。其中男208例，女55例，年龄范围 18～80岁，平均年龄(44.18±14.46)岁。

二、方法

采用酶联免疫吸附试验 (enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA) 检测 HIV-1抗体为阳性，经蛋白免疫印迹试验(weastern blot，WB) 证实为HIV感染，试剂为HIV免疫印迹确认试剂(上海英旻泰生物技术有限公司)。

采用MicroDSTTM微孔板药敏检测试剂盒(珠海银科医学工程股份有限公司)进行12种一、二线抗结核药品[异烟肼(INH)、利福平(RFP)、利福布汀(Rfb)、链霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、阿米卡星 (Am)、卷曲霉素(Cm)、利奈唑胺(Lzd)、丙硫异烟胺(Pto)、对氨基水杨酸(PAS)]的耐药性检测。步骤如下：在96孔板中每孔加入200 μl含菌的药敏试验培养基(除4个阴性对照孔)，盖上盒盖密封后置 37 ℃培养 7～14 d观察结果。

采用结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法，北京博奥生物科技有限公司)检测对RFP和INH耐药的3个相关基因rpoB、katG及inhA基因的野生型及不同突变型耐药基因突变。步骤如下：首先，将结核分枝杆菌的 DNA 从培养分离纯化的菌株或直接从临床样品中提取出来; 对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记，将扩增并荧光标记的基因序列与芯片上的探针进行杂交反应; 最后，芯片扫描成像，用配套软件进行判读。结果判读：待测菌株某一基因所有检测位点均为野生型则报告为野生型，即敏感；若待测菌株某一个或几个位点为突变型，则报告全部为突变型，即耐药。

三、诊断标准与定义

1. 肺结核及肺外结核诊断标准：参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[7]。

2. 耐药结核病诊断：参照《耐药结核病化学治疗指南(2015)》[8]。

3. HIV感染/AIDS诊断：参照《中国艾滋病诊疗指南(2018版)》[9]。

4. 初治与复治结核病定义：参照《WS 196—2017 结核病分类》[10]。(1)初治结核病患者指符合下列情况之一者：①从未因结核病应用过抗结核药品治疗的患者；②正进行标准化疗方案规则用药而未满疗程的患者；③不规则化疗未满1个月的患者。(2)复治患者指符合下列情况之一：① 因结核病而不合理或不规则用抗结核药品治疗≥1个月的患者；②初治失败和复发患者。

5. 耐药结核病定义：(1)单耐药结核病指仅对1种一线抗结核药品耐药；(2)耐多药结核病(MDR-TB)指至少对INH和RFP同时耐药；(3)广泛耐药结核病(XDR-TB)指在耐多药的基础上至少同时对1种二线注射类和1种氟喹诺酮类抗结核药品耐药。

四、统计学处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计数资料以“率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、263例结核病并发HIV感染者耐药分布情况

263例结核病并发HIV感染者中，总的对抗结核药品的耐药顺位依次如下：INH(14.8%,39/263)、RFP(11.0%,29/263)、Sm(8.4%, 22/263)、Mfx(6.5%, 17/263)、Rfb(6.1%,16/263)、Lfx(4.6%,12/263)、EMB(4.2%, 11/263)、Pto(3.4%, 9/263)、PAS(3.0%,8/263)。其中初治结核病并发HIV感染者耐药顺位如下：INH(7.9%,16/202)、Sm(5.4%,11/202)、RFP(5.0%,10/202)、Mfx(3.0%, 6/202)、Rfb(3.0%, 6/202)、EMB(2.5%,5/202)、Pto(2.0%, 4/202)、Lfx(1.5%,3/202)、PAS(1.5%, 3/202)。复治者耐药顺位如下：INH(37.7%, 23/61)、RFP(31.4%,19/61)、Sm(18.0%, 11/61)、Mfx(18.0%,11/61)、Rfb(16.4%, 10/61)、Lfx(14.8%,9/61)、EMB(9.8%, 6/61)、Pto(8.2%,5/61)、PAS(8.2%,5/61)。初复治患者均未发现对Am、Cm、Lzd耐药菌株(表1)。

二、 结核病并发HIV感染患者结核分枝杆菌耐药基因突变情况

263例结核病并发HIV感染患者中，通过DNA微阵列芯片法检测出耐INH 35株，耐RFP 26株；对INH耐药的基因突变顺位依次为katG24株(68.6%)、inhA11株(31.4%)；对RFP耐药的耐药基因突变位点顺位依次为rpoB531位点16株(61.5%)，rpoB526位点7株(26.9%)，rpoB516位点3株(11.5%)。

讨 论

目前已证实HIV感染会增加患者感染耐药结核分枝杆菌的风险[11]，与单纯的HIV感染者相比，结核病并发HIV感染患者死亡率相对较高，并且大大缩短了患者的生存时间[12]。因此，探讨结核病并发HIV感染具有重要的公共卫生意义，对患者预后至关重要。

国外一项关于HIV感染和耐多药结核病相关性的Meta分析中指出，在基于人群对照的研究中，HIV感染者发生耐多药结核病的概率为24.0%[13]。本研究中，263例结核病并发HIV感染患者中，总体耐药率为29.7%，与上述Meta分析结果总体相符。目前已证实对于HIV阴性的人群，复治结核病患者总耐药率和耐多药率均明显高于初治患者[14]。本研究显示，对于结核病并发HIV感染患者，复治者发生耐药结核病的概率也较初治者明显增加，整体上以一线抗结核药品为主，其中对INH、RFP、Sm、Mfx、Lfx、Rfb的耐药率均超过10%，对EMB、Pto及PAS的耐药率相对较低。分析本研究中结核病并发HIV感染人群的高耐药率结果，可能与以下原因有关：(1)药物使用暴露量。应加强对结核病并发HIV感染人群督导服药管理及结核病的健康宣传教育，减少不规律用药，从而降低获得性耐药率。同时注意用药过程中抗病毒和抗结核药品之间的相互作用，避免诱导出现的继发结核分枝杆菌耐药。(2)HIV 感染易并发肺外结核，可能因抗结核治疗疗程不足而导致结核病复发，诱导耐药的发生。

表1 一、二线抗结核药品耐药情况在结核病并发HIV感染者中的分布与比较

注a：初治患者与复治患者耐药率比较

近年来，随着氟喹诺酮类药品在临床的广泛应用，对Mfx及Lfx的耐药率有上升趋势。本研究中，对上述两药的总耐药率达11.0%(29/263)。氟喹诺酮类药品主要通过葡萄糖醛酸和硫酸盐结合的细胞溶质酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶和硫转移酶代谢，与目前大多数抗病毒药品无确切相互作用和(或)重叠毒性反应。国外也曾报道在结核病并发HIV感染治疗过程中，采用Mfx替代利福霉素也取得不错的治疗效果[15]，故而临床更易普及治疗。加之其相对容易的获取途径和在其他呼吸系统疾病大量不规范的使用均会导致对氟喹诺酮类药品耐药率的升高。故而医务人员应重视监管氟喹诺酮类药品的临床应用，减少获得性耐药的发生，也是提高结核病并发HIV感染患者治愈率的有效手段之一。

本研究中，对RFP耐药以rpoB531位点突变最为常见，其次为rpoB526及rpoB516位点突变；对INH耐药以katG基因突变常见，其次为inhA基因突变。RFP通过与 RNA聚合酶β亚单位结合，干扰、抑制mRNA的转录，从而达到杀菌的效果；rpoB基因突变使RNA聚合酶高度保守的氨基酸发生置换，进而阻止与RFP的结合而导致耐药。突变一般发生在rpoB507～533位27个氨基酸密码子组成的对RFP耐药决定区内。文献报道，在HIV阴性的结核病人群中，最常见的突变位点是531位的丝氨酸(Ser)(40%～60%)、526位的组氨酸(His)(30%～36%)、516位的天冬氨酸(Asp)(7%～9%)[16]，其中rpoB531位点突变一般导致高水平耐药。对INH的耐药机制与katG、inhA和ahpC基因的启动子缺失或突变有关，其中katG完全缺失或点突变是最主要的耐药机制[17]。本研究结果与文献报道的HIV阴性的结核病耐药基因分布总体相符[18-19]，但突变类型少于HIV阴性结核病人群，可能与本研究样本量少有关；另一方面还可能与不同地区MTB耐药的基因突变类型差异有关。

本研究为回顾性研究，尚未对比本院同期HIV阴性结核病患者耐药基因谱分布情况，同时也未深入分析更多耐药基因突变的差异。但可大体反映出成都地区结核病并发HIV感染患者耐药谱及耐药基因分布情况的变化。考虑到结核病并发HIV感染者MTB耐药及耐药基因突变与结核病总体人群相近，当临床难以获得其具体耐药结果时，抗结核用药可适当参考当地结核病总体人群的耐药参数，合理制定抗结核方案，对控制结核病并发HIV感染患者的预后具有重要作用。