云南汉族人群C2orf91 基因rs6740960 位点多态性与非综合征性唇腭裂的相关性

李秀玲，董旭东，颜 芳，陈醇侯，晴 沙，刘焕玲

（云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院产科，云南昆明 650032）

非综合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate，NSCL/P） 是人类最常见的出生缺陷之一，约占唇腭裂的50%～70%，是无其他系统器官畸形、不属于任何综合征范围之内的唇裂伴或不伴腭裂和单纯性腭裂的总称。NSCL/P 的发病原因非常复杂，迄今普遍归因于易感基因和环境因素协同作用，是一种多基因遗传疾病。NSCL/P 发生率因区域、民族和人种各有不同差别极大，全球发病率为1/700[1-2]，其中发病率最高的是亚洲，为1/500；发病率最低的是非洲，为1/2 500；欧洲的白种人则介于两者之间。国内NSCL/P患病率多达1.42/1 000[3-4]，总发生率占我国出生缺陷的14.0%。因此，探索NSCL/P 的发病原因，做到提前预防，减低婴幼儿出生缺陷率，对进一步提高人口素质极为重要。

NSCL/P 是目前遗传疾病的研究热点之一，被人们发现的候选基因和易感位点越来越多，C2orf91 基因rs6740960 位点是近几年来发现的新的易感位点，其位于2p21 染色体内[5]，在下颌骨、上颚和鼻咽区的发育过程中均有表达，提示C2orf91 基因rs6740960 位点的突变可能与NSCL/P的发病有关。笔者过对云南汉族人群NSCL/P 患儿rs6740960 位点基因型进行检测及分析，以探讨C2orf91 基因上rs6740960 位点多态性与非综合征唇腭裂的相关性。本研究在国内属首次报道。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2015年9月至2019年9月期间在云南省第一人民医院就诊的孕妇，其中非综合征性唇腭裂胎儿148例作为病例组。入选胎儿染色体结果正常，排除其他先天性疾病。排除孕妇吸烟、酗酒、叶酸不足及有毒有害物质接触史。随机选取180例新生儿作为控制组。所有检测对象均排除先天性畸形。本研究课题获得了所有研究对象父母的知情同意，并通过了云南省第一人民医院伦理审查委员会的审查。两组研究对象均为云南汉族人群。

1.2 标本采集与保存

病例组胎儿采集羊水、脐血或者引产组织，对照组新生儿收集新鲜脐带血，均立即置于-20℃冰箱中，随后转至-70℃冰箱保存备用。

1.3 DNA 提取

采用全血DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，试剂盒购自昆明硕擎生物科技有限公司。

1.4 PCR 扩增

设计引物，Forward primer：5'-CCAGCGCTCTGG ATGTCATTA-3'，Reverse primer：5'-CCTGGTCGT GGGAAACTCTG-3'。PCR 总反应体系为25 μL，包括：10X ThermoPol or Standard Taq Reaction Buffer 2.5 μL；10 mM dNTPs 0.5 μL；10 μM Forward Primer 0.5 μL；10 μM Reverse Primer 0.5 μL；Template DNA 500 ng；Taq DNA Polymerase* 0.125 μL；加Nuclease-free water 至25 μL。反应条件：95℃预变性30 s，PCR 循环条件为：95℃变性20 s，57℃退火30 s，68℃1 min，共30 个循环，最后72℃延伸5 min。

1.5 Sanger 测序

使用能在DNA 模板链上互补掺入却不能延伸的四种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 与正常的四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 竞争，合成的互补链可以在任何位置终止，获得长短不一的反应产物，通过电泳分离，从四条泳道上的条带顺序就能读出DNA 的序列。此技术又被称为第一代测序技术[6]。

1.6 统计学处理

所有数据输入SPSS 软件建立数据库并进行统计分析。对病例组与对照组人群等位基因和基因型分布完成Hardy-Weinberg 平衡检测，评估所选样本是不是具备代表性。采用Pearson χ2test 对两组基因型以及等位基因频率相比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C2orf91 基因rs6740960 位点的基因型测序结果

病例组和对照组野生纯合子TT 基因型共检出315例，突变杂合子AT 基因型共13例，两组突变纯合子AA 基因型均未查出（从负链方向测序，见图1、图2）。

图2 突变杂合子AT 基因型Fig.2 Mutant heterozygote genotype AT

2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验

病例组和对照组等位基因和基因型实际值和预期值的分布与Hardy-Weinberg 平衡定律相一致（P＞0.05），说明样本具备代表性。

两组等位基因分布的Hardy-Weinberg 平衡检测结果：病例组χ2=0.146（P=0.703），对照组χ2=0.091（P=0.763），结果表明两组的等位基因分布合与Hardy-Weinberg 平衡定律相符（P＞0.05），见表1。

两组基因型分布的Hardy-Weinberg 平衡分析结果：病例组χ2=0.203（P=0.903），对照组χ2=0.175（P=0.916），结果得出两组人群的基因型分布与Hardy-Weinberg 平衡定律相一致（P＞0.05），见表2。

2.3 等位基因和基因型频率的χ2 检验

病例组野生纯合子TT 基因型检出143例，突变杂合子AT 基因型检出5例，对照组野生纯合子TT 基因型检出172例，突变杂合子AT 基因型检出8例，两组突变纯合子AA 基因型均未查出。经Pearsonχ2检验，χ2=0.042（P=0.837），两组的C2orf91 基因rs6740960 位点等位基因频率分布没有统计学差异（P＞0.05），见表3；经Pearson χ2检验，P=0.779，两组的C2orf91 基因rs6740960基因型频率分布在统计学上没有差异（P＞0.05），见表4。

表1 病例组和对照组等位基因Hardy-Weinberg 平衡分析Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test of allele distribution in the case group and control group

表2 病例组和对照组基因型Hardy-Weinberg 平衡分析Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium test of genotype distribution in the case group and control group

表3 病例组和对照组C2orf91 基因rs6740960 位点的等位基因频率（n）Tab.3 Allele frequency of rs6740960 locus of c2orf91 gene between the case group and control group （n）

表4 病例组和对照组C2orf91 基因rs6740960 位点的基因型频率（n）Tab.4 Genotype frequency of c2orf91 rs6740960 locus between the case group and control group （n）

3 讨论

人类基因组关联分析（genome wide association studies，GWAS） 研究发现与唇腭裂遗传相关的候选基因有VAX1、WNT3、MSX1、MAFB、EPHA3、THADA、ABCA4、MTHFR、IRF6、ZNF-533、SUMO1、MSX1、FOXE1、CRISPLD2 等20 多个[7-14]，并且不断有GWAS 报道新的易感位点有rs6740960、rs4901118、rs3746101、rs28689146 等[15-20]。其中位于C2orf91 基因的rs6740960 位点，属于长链非编码RNA 的基因[18]，在下颌骨、上颚和鼻咽区的发育过程中均有表达，其突变会影响面部形态特征的发育。Ludwig 等[5]证明了在人类神经嵴细胞（hNCC） 和小鼠胚胎颅面组织中活跃的基因组区域rs6740960 位点高表达；Karlijne Indencleef[18]等研究发现C2orf91 基因rs6740960 位点T→A 的突变会明显影响胎儿下颌骨的发育（P＜0.05）。

本研究中对非综合征性唇腭裂病例组和对照组等位基因和基因型分布分别进行Hardy-Weinberg检验，结果显示两组的等位基因和基因型分布与哈伦平衡定律相符合，说明了本研究所选群体具备代表性。对病例组与对照组研究对象的等位基因频率和基因型频率分布进行相关性研究显示：两组的等位基因和基因型频率均无显著统计分析差别。实验结果说明云南汉族人群中C2orf91 基因rs6740960 位点单核苷酸多态性与非综合征性唇腭裂的发生无相关性。

由于NSCL/P 具有遗传异质性，即使同一个位点，不同地域、民族或种族，研究结论有可能不同。云南是一个少数民族聚居的地方，民族具有多样性，为了避免民族带来的差异性，所以只选取云南汉族人群。NSCL/P 作为多因素交互作用的疾病，本研究中只考虑了C2orf91 基因一个常见多态性位点与NSCL/P 的关系，有一定的局限性，在以后的研究中我们应当运用表观遗传学、基因表达和流行病学，从不同角度、不同层面探索NSCL/P 的发病机制。同时本研究病例数量不够大，统计学检验功效较低，是造成阴性结果的原因之一，因此判断rs6740960 是否为NSCL/P 的相关位点，需要加大样本量进行筛查及验证。

综上所述，本研究显示C2orf91 基因rs6740960 位点单核苷酸多态性与云南汉族人群NSCL/P 的发生没有相关性，但鉴于C2orf91 基因rs6740960 多态性位点与NSCL/P 发病关系在国内尚无报道，仍需要对其进一步探讨。C2orf91 作为一个新的易感基因，对该基因的研究还比较浅显，还只处在基因位点与NSCL/P 关系的研究上，本研究可为以后对该基因突变与唇腭裂发病机制的研究提供新的思路。