G 蛋白偶联受体激酶5 与非小细胞肺癌的临床相关性

陈本超，李 恒，刘 超，王书廷，李高峰

（昆明医科大学第三附属医院胸外二科，云南昆明 650100）

肺癌全球高发，严重威胁人民健康，肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤之首[1]。根据组织病理学特性，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 是肺癌的一个类别，在肺癌中NSCLC 占其中85%的比例[2-3]。虽然目前极大的推广了肺癌的早诊早治理念，但仍有大部分NSCLC患者确诊时已属于晚期，目前对于晚期肺癌的主要治疗方法仍以内科治疗为主[4]。但伴随近年来肿瘤分子靶向治疗和免疫治疗的潜入研究，靶向药物以其局部杀伤的高效性及安全性备受关注，对于有基因突变的晚期NSCLC 患者，靶向治疗已逐渐成为一线用药的首选[5]。然而部分患者通过基因检测未发现相应靶基因突变，对于这部分患者临床上仍然以传统的放化疗为主要治疗方式，因此探求一种新的相对广谱的靶点已成为目前治疗肺癌的热点研究。

G 蛋白偶联受体激酶5（G protein-coupled receptor kinases 5，GRK5） 是GRKs 家族其中一种亚型，其通常分布于身体各个器官组织，尤其在肺和心脏中有较高表达，有研究表明GRK5 是多种疾病以及恶性肿瘤的调控蛋白[6-7]。虽然GRK5 在恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用，但是GRK5 在非小细胞肺癌中的作用机制研究鲜有报道。本研究拟利用免疫组织化学法探究NSCLC 中GRK5 的表达情况，并研究其与NSCLC 患者临床关联性，以期能为临床NSCLC 的治疗提供新的药物靶点和新的预后指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料收集昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院） 胸外二科2017年8月至2018年12月176例手术切除的NSCLC 癌巢组织蜡块及其癌旁组织蜡块。蜡块对应患者基本临床信息见表1，本课题已通过伦理委员会审查，所有患者术前均已签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂GRK5 抗体（NO.ab64943，abcam 公司，英国），动物非免疫血清（羊） （SP KIT-B3，迈新公司，福州），ABC 抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（NO.K5007，Dako 公司，丹麦）

1.2 方法

免疫组化检测NSCLC 中GRK5 的表达将组织蜡块用轮片切片机切成4 μm 制成病理切片，严格按照烤片、二甲苯脱蜡、各级浓度乙醇水化、3%过氧化氢溶液处理、5%羊血清封闭、GRK5 一抗（浓度1:1 000） 孵育过夜、ABC 法染色、苏木素复染、各级浓度乙醇脱水、中性树胶进行封片等免疫组化实验步骤。由两位副主任病理医师对组织标本的免疫组化染色切片分别在显微镜下参照标准Fromowitz 方法进行评估，如果对同一病理切片的病理评价结果有差异，则由两位医师同时在双头显微镜下进行再次评估和商议后，确定最终结果。

表1 非小细胞肺癌患者临床病例特征［n（%）］Tab.1 Clinical characteristics of patients with non-small cell lung ［n（%）］

1.3 统计学处理

本研究实验数据采用SPSS 统计学软件分析，以α=0.05 作为检验水准，其中率的比较进行卡方检验（Chi-Square test），多组间比较用单因素方差分析，两组间比较作独立样本t检验。生存分析采用Kaplan-Meier 数据库（http://kmplot.com） 进行分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁组织中的表达情况

在176例NSCLC 患者癌巢中，其中92例GRK5 阳性表达，阳性表达率52.27%，84例阴性表达，阴性表达率47.73%；在患者癌旁肺组织中，其中64例GRK5 阳性表达，阳性率36.36%，112例阴性表达，阴性表达率63.64% （图1），GRK5在NSCLC 癌巢中的阳性表达率相较于癌旁肺组织高，经统计学分析P=0.003，差异有统计学意义，见表2。

图1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁组织中表达结果Fig.1 GRK5 expression in tumor nests and adjacent tissues of NSCLC

表2 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁组织中的表达情况［n（%）］Tab.2 Expression of GRK5 in tumor nests and adjacent tissue of NSCLC ［n（%）］

2.2 GRK5 在非小细胞肺癌组织中的表达与临床的关联性

在176例NSCLC 患者中，共有124例肺腺癌，其中72例阳性表达，阳性率58.06%，52例阴性表达，阴性表达率41.94%；共有52例肺鳞癌，其中20例GRK5 阳性表达，阳性表达率38.46%，32例阴性表达，阴性表达率61.54%，GRK5 在肺腺癌中的阳性表达率较鳞癌高，经统计学分析差异有统计学意义（P=0.018），见表3。而本研究中GRK5 的表达与NSCLC 患者的年龄、性别、病理分期、肿瘤大小、淋巴结是否转移等无临床关联性（P＞0.05）。

2.3 GRK5 在非小细胞肺癌中的表达与患者预后的关联性

通过Kaplan-Meier Plotter 数据库对1 926例肺癌患者进行生存分析，结果显示GRK5 高表达患者中位生存时间为63 个月，而GRK5 低表达患者中位生存时间为77.77 个月，高表达患者总生存时间（overall survival，OS） 显著低于低表达患者OS，差异有统计学意义（P=0.001，HR 1.24，95%CI 1.09～1.4）。同时在肺腺癌中GRK5 高表达也提示不良预后（P=0.000 3），而在鳞癌中GRK5 的表达与预后无相关性（P=0.65），见图2。

表3 GRK5 在NSCLC 组织中的表达与组织学类型的临床关系［n（%）］Tab.3 The clinical relationship between GRK5 expression and histological types in NSCLC ［n（%）］

图2 GRK5 在非小细胞肺癌中的表达与总生存期的相关性Fig.2 The correlation between GRK5 expression and overall survival in NSCLC

3 讨论

GRK5 是GRKs 家族其中一种亚型，其通常分布于身体各个器官组织，主要表达于细胞质膜上，尤其在肺和心脏中有较高表达，在其他实体组织器官中也可检测到微量GRK5 表达[12]。有学者研究发现，GRK5 可以直接或间接调节G 蛋白偶联受体及其下游蛋白信号分子从而参与相关疾病或肿瘤的信号转导[13]。在GRK5 基因敲除小鼠中，p53 的蛋白水平以及DNA 损伤导致的胸腺细胞凋亡均有升高[14-15]，这些研究表明，GRK5 不仅与心血管系统疾病的发生发展有相关性[16]，同时在肿瘤的增殖、分化中可能具有重要的作用。

本实验研究结果显示，GRK5 主要在NSCLC癌巢及癌旁肺组织的细胞膜和细胞质表达，而信号调节通路中的关键蛋白往往位于细胞膜，且已有研究表明GRK5 可以调控前列性肿瘤、肾细胞癌以及胶质瘤的生长[17-18]，由此笔者分析GRK5 可能是肺癌增殖、分化等相关调节信号通路中的重要蛋白。在本实验176例NSCLC 中，GRK5 在NSCLC 癌巢中的表达显著高于癌旁肺组织，同时通过生存分析结果显示GRK5 高表达肺癌患者OS 显著低于低表达患者，该生存分析结果与我们的实验结果一致，由此可以分析GRK5 可能促进NSCLC 细胞的异常分化、增殖等。有研究表明，这可能与GRK5 能够抑制p53 依赖的细胞凋亡和G1 期阻滞有关[15，19]。在与临床特征关联性分析中发现，GRK5 在腺癌中的表达高于鳞癌，而与其他临床特征无相关性，生存分析结果显示在肺腺癌中GRK5 高表达提示不良预后，而在鳞癌中GRK5 的表达与预后无相关性。综上笔者可以得出结论，GRK5 在NSCLC 中可能是一个促癌因子，NSCLC 的增殖、分化等可能与它的过表达有关，尤其是在肺腺癌中。笔者的研究结果与已有相关研究结果相一致[20]。因此未来笔者有望将GRK5 作为肺腺癌的特异性肿瘤分子标志物或药物靶点，从而为肺腺癌的诊断和治疗提供新的分子标志物和靶点。

虽然本研究探讨了GRK5 在NSCLC 中的表达与临床及预后的相关性，但笔者需要更大样本免疫组化验证以及进一步的细胞学和动物学实验探索其在NSCLC 的分化、增殖、凋亡中的作用及其内在机制。因此，本研究的意义在于为进一步研究GRK5 在NSCLC 中的发病机制提供了基础方向，为NSCLC 的诊断、治疗和预后提供了潜在的新靶点。