UPLC/Q Exactive MS 快速测定食蟹猴体内黄藤素的血药浓度

张培培，崔佳丽，周艺佳，刘红斌，柯 瑾

（1） 昆明卫生职业学院药学院，云南昆明 650600；2） 云南白药集团药物安全性评价中心，云南昆明 650111；3） 云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）

黄藤为防己科植物黄藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤茎，又名天仙藤、土黄连、金锁匙、藤黄连等，主要分布在我国的云南、广西、广东等地以及越南、柬埔寨、缅甸，是当地少数民族常用的中药和天然染料[1]。现收载于2015年版《中国药典》，其味苦，性寒，归心、肝经，具有清热解毒、泻火通便的功效[2]，而且能够防治多种感染性疾病，如妇科炎症、外科感染、菌痢、肠炎、呼吸道感染、眼结膜炎等[3]。黄藤中抗菌主要有效成分为黄藤素（C21H22ClNO4，387.86），又名盐酸巴马汀、盐酸棕榈碱、掌叶防已碱、非洲防已碱等，是中国首先自行研制的纯天然植物药，被当代医学称为“植物抗生素”。在一定程度上，弥补化学抗生素问题[4]。

随着现代分析仪器的发展，黄藤素的体内、外药物分析方法不断优化，早期有学者[5-6]采用紫外分光光度法进行黄藤素测定，随着高效液相色谱仪（HPLC） 的普及，逐渐采用HPLC 法[7-12]测定黄藤素片、注射液、粉针剂等制剂中黄藤素的含量。黄藤素体内药物分析方法很多，有高效液相色 谱-荧 光 检 测（HPLC-FLU） 法[13]、（RP）-HPLC 法[14-15]等。由于黄藤素口服吸收较差[16-17]，体内血药浓度较低，因此需要建立灵敏度更高的分析测定方法。有学者[18-19]采用液质联用的技术进行黄藤素血药浓度分析。为了进一步提高分析速度、简化样品处理过程，本研究建立一种特异性强、准确、快速、灵敏的UPLC-Q Exactive-MS 测定方法[20]，按照《中国药典》 （2015年版） 四部“生物样品定量分析方法验证指导原则”项下进行方法学验证，为黄藤素药代及毒代研究提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药黄藤素对照品（盐酸巴马汀，PMH，C21H22ClNO4，相对分子量为387.86，含量为86.8%，批号110732-201611，中国食品药品检定研究院） ；内标盐酸小檗碱对照品（C20H18ClNO4，相对分子量为371.81，含量为86.7%，批号110713-201212，中国食品药品检定研究院）；食蟹猴空白血浆（广东悦源动物养殖有限公司，合格证号：SCXK（粤） 2015-0038，15%EDTA-Na2 抗凝）。

1.1.2 试剂甲酸（批号10K11-F211，Admas）；乙腈为质谱纯（J.T.Baker），实验用水为超纯水。

1.1.3 仪器Thermo UltiMate 3000 液相色谱系统（美国赛默飞），Qexactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞），MD200 氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司），DV215CD 分析天平（奥豪斯仪器（上海） 有限公司），XW-80A 涡旋混合仪（上海精科实来有限公司），Allegra64R 高速离心机（美国BECKMAN COULTER 公司），Research 移液器（美国Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 含量测定条件研究色谱柱Hypersil GOLD Dim C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相为乙腈B-水A（含0.1%甲酸），流速为0.3 mL/min，柱温30℃，进样10 μL，分析时间为5 min。

质谱条件研究：电喷雾离子源（ESI），正离子方式检测；喷雾电压3.50 kV；毛细管温度350℃；离子源温度350℃；鞘气和辅助气分别为35 arb 和12 arb；S-lens RF 电压为50 V；扫描方式采用正离子t-SIM 模式，分辨率（R） 70000FWHM，自动增益控制（AGC） 和离子注入时间（IT） 分别设为5e4 和200 ms；isolation window 设为4.0 m/z，选择离子通道：PMH，[M-Cl]+，m/z 352.154 33；盐酸小檗碱（IS），[M-Cl]+，m/z 336.12303。喷雾气为氮气，碰撞气为高纯氮气。

1.2.2 试剂配制（1） PMH 对照品溶液的配制：分别精密称取黄藤素对照品5.91、5.87 mg，至已校验25 mL 容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.205 和0.204 g/L（浓度计算时以含量86.8%进行折算） 的黄藤素标准储备液，同法配制两份，其中浓度高的作为校正曲线用储备液，另一份作为质控用储备液，2 ℃～8℃冰箱保存备用。并进行配制重现性考察和2℃～8℃冷藏70 d 稳定性考察，结果显示配制重现性符合要求，此条件下PMH 稳定。临用前，校正曲线储备液用乙腈按比例稀释制成浓度分别为0.525、1.05、2.62、6.56、16.4 和41.0 mg/L 系列PMH 标准工作液；质控储备液同法制成浓度分别为0.832、5.20和32.6 mg/L 系列质控工作液；（2） 盐酸小檗碱标准溶液配制：精密称取内标盐酸小檗碱5.86 mg，转至已校验50 mL 容量瓶，加乙腈溶解后定容至刻度，摇匀，得浓度为0.102 g/L （浓度计算时以含量86.7%进行折算） 的内标储备液，取盐酸小檗碱内标储备液10～1 000 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，混匀，得浓度为1.02 mg/L 的盐酸小檗碱工作液，2℃～8℃冰箱保存备用；（3） 0.1%甲酸溶液配制：精确吸取甲酸1.0 mL，用超纯水稀释并且定容到1 L，0.22 μm 微孔滤膜抽滤后，超声5 min 后再使用。

1.2.3 血浆样品处理精密吸取食蟹猴血浆50 μL至对应用记号笔标识的1.5 mL 离心管中，再精密加入400 μL 盐酸小檗碱内标工作液，涡旋2 min，于2～8 ℃，15 000 r/min 离心10 min，取上清液50 μL，加入乙腈950 μL 涡旋混匀，再从前述混匀液中取50 μL，加入乙腈950?L 涡旋混匀，于2～8℃，15 000 r/min 离心10 min，取出上清液适量至进样瓶中，即得。

1.2.4 体内药物分析方法学验证（1） 特异性 取食蟹猴空白血浆5 份、空白血浆+MPH+IS 1 份、预实验中获得的第1 批给药后第1 个采血时间点任一样品，按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，比较各图谱，考察方法特异性。（2） 残留考察 按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，制备5 份空白样品、5 份标曲最低浓度点样品及1 份标曲最高浓度点样品，按照“高浓度-空白样品”间隔进样，计算每一空白血浆样品中黄藤素峰面积与5 份标曲最低浓度点测定所得峰面积平均值的比值，应小于20%；同时计算每一空白血浆样品中IS 峰面积与5份标曲最低浓度点测定所得IS 峰面积平均值的比值，应小于5%。（3） 基质效应考察 精密吸取5 μL 低、中、高浓度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 质控样品溶液，再精密吸取“1.2.2（2） 盐酸小檗碱标准溶液”项下1.02 mg/L 的盐酸小檗碱工作液20 μL，常温氮吹至干。取50 μL 空白食蟹猴血浆至另一1.5 mL 离心管中，精密加入400 μL乙腈，涡旋2 min，于2℃～8℃条件下15 000 r/min离心10 min，精密移取上清液225 μL 至前述1.5 mL 离心管中，后续按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，各浓度平行5 份，分析测定得到的黄藤素峰面积（PS 有） 和盐酸小檗碱峰面积（PIS 有）。以水代替空白食蟹猴血浆，精密吸取10 μL 低、中、高浓度PMH 质控样品溶液，按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，各浓度平行5 份，分析测定得到的黄藤素峰面积（PS 无） 和盐酸小檗碱内标峰面积（PIS 无）。

黄藤素基质效应计算分公式：MFS%=PS 有/PS 无×100。

盐酸小檗碱基质效应计算公式：MFIS%=PIS有/PIS 无×100。

同一样品黄藤素的基质效应与内标盐酸小檗碱的基质效应的比值，即为归一化基质效应因子。归一化基质效应因子相对标准差应小于15%。（4）线性关系考察 精密吸取浓度为0.525、1.05、2.62、6.56、16.4 和41.0 mg/L 系列PMH 标准工作液10?L，氮气吹干后，按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，以盐酸巴马汀峰面积（Ab） 和内标峰面积（Ah） 的比值为纵坐标Y，盐酸巴马汀工作液浓度的1/5 为横坐标X，用加权（1/X2） 最小二乘法拟合，不过原点，分别获得每一批标准曲线回归方程。方程相关系数r2应不小于0.99。（5） 批内与批间精密度考察 精密吸取10 μL 低、中、高浓度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 质控样品溶液和0.525 mg/L 的PMH 校正溶液，按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，各浓度平行5 份，连续测定3 批（每天一批），用随行校正曲线计算质控样品的浓度，分别表示批内与批间精密度，定量下限的RSD＜20%，其余浓度RSD＜15%。（6） 批内与批间准确度考察 与前述“（5） 批内与批间精密度考察”平行进行，用随行校正曲线计算质控样品的浓度后，计算每一浓度测定的平均值与标示值的比值?100%，分别表示批内与批间准确度，定量下限批内与批间准确度应在80%～120%，其余浓度应在85%～115%范围内。（7） 稳定性考察 进样溶液稳定性考察：精密吸取10 μL 低、中、高浓度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 质控样品溶液，氮气吹干后，按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作，制备成进样溶液后，分别置室温和2℃～8℃存放置2 d，每个浓度每个时间点平行5 份。

未处理血浆样品稳定性考察：精密吸取10 μL 低、中、高浓度PMH（0.832、5.20 和32.6 mg/L） 质控样品溶液，氮气吹干后，加入50 μL 空白血浆，涡旋混匀后，分别于室温放置1 d、-20℃存放35 d 室温冻融3 次和-20℃存放1 d、10 d、35 d 的稳定性。每个浓度每个时间点平行5份，后按“1.2.3 血浆样品处理”项下操作。

随行校正曲线计算质控样品的浓度后，计算每一浓度测定的平均值与标示值的比值×100%，应在85%～115%范围内。

1.3 统计学处理

回归方程及测定浓度为仪器工作站软件“Thermo Xcalibur”处理，其余数据应用SPSS 统计学软件进行处理，以均数±标准差（） 表示。

2 结果

2.1 含量测定色谱条件

黄藤素（PMH） 和盐酸小檗碱（IS） 的保留时间分别为2.46 min 和2.47 min。洗脱条件见表1。

2.2 方法学验证结果

2.2.1 特异性考察特异性样品中虽然检测到目标物PMH 及内标盐酸小檗碱，但目标物干扰组分影响率均小于20%，内标干扰组分影响率均小于5%，说明空白血浆中的内源性物质对样品测定无干扰，见图1。

2.2.2 残留考察从测定结果可知，PMH 和内标的残留率分别为7.73%～10.37%、0.37%～0.97%，本方法的残留量对定量下限的影响可以忽略不计。

2.2.3 基质效应考察黄藤素与内标的归一化基质效应因子相对标准偏差RSD%小于15%，符合要求，见表2。

2.2.4 线性关系考察以血药浓度对峰面积比值建立回归方程，得到血浆样品中黄藤素的标准曲线，见表3。由表3 可知，血浆中黄藤素浓度在105.0～8 200 μg/L 内浓度与峰面积之间有良好的线性关系（r2＞0.999）。

2.2.5 批内与批间精密度考察批内及批间精密度的RSD%均小于15%，检测方法的精密度满足要求，见表4。

2.2.6 批内与批间准确度考察不同浓度批内及批间准确度均在85%～115%范围内，检测方法的准确度满足要求，见表5。

2.2.7 稳定性考察（1） 进样溶液稳定性考察（表6）：从表6 结果可知，进样溶液在室温和2～8℃存放置2 天稳定性符合要求；（2） 未处理血浆样品稳定性考察：未处理血浆样品在室温放置1 d、-20℃存放35 d 室温冻融3 次和-20℃存放1 d、7 d、35 d 的稳定性符合要求，见表7。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions

图1 血浆样品的特异性考察（SIM）Fig.1 Inspection on specificity of monkey plasma sample(SIM)

表2 黄藤素与内标基质效应［n=5，（）］Tab.2 Linear relationship of PMH and IS in monkey plasma ［n=5，（）］

表2 黄藤素与内标基质效应［n=5，（）］Tab.2 Linear relationship of PMH and IS in monkey plasma ［n=5，（）］

表3 黄藤素在血浆中的线性关系Tab.3 Linear relationship of PMH in monkey plasma

表4 精密度实验结果［n=5，（）］Tab.4 The results of precision ［n=5，（）］

表4 精密度实验结果［n=5，（）］Tab.4 The results of precision ［n=5，（）］

表5 准确度实验结果［n=5，（）］Tab.5 The results of accuracy［n=5，（）］

表5 准确度实验结果［n=5，（）］Tab.5 The results of accuracy［n=5，（）］

表6 进样溶液稳定性考察结果［n=5，（）］Tab.6 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］

表6 进样溶液稳定性考察结果［n=5，（）］Tab.6 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］

3 讨论

充分利用现代分析检测设备，建立科学、灵敏、特异、快速的黄藤素检测技术与方法，是进行黄藤素新产品研发的必要途径，是实现药品质量可控性的有力保证，也是展开药代动力学等更深层次研究的重要技术手段。本研究建立的UPLC/Q Exactive MS 快速测定食蟹猴体内黄藤素的血药浓度的方法，线性范围宽，分析时间短，准确度好、灵敏度高、特异性强，适于黄藤素药代及毒代动力学分析检测。

实验研究中发现，进样溶液浓度在0.2625～20.50 μg/L 基础上还可以降低20 倍，依然符合定量下限10 倍信噪比的要求，可为黄藤素药代动力学研究提供参考。

表7 未处理血浆稳定性考察结果［n=5，（）］Tab.7 The results of stability in injection solution ［n=5，（）］