腹腔灌注化疗对昆明小鼠认知功能的影响

雷学芬，王 琳，唐浩然，鲍天昊，史润娇，柯 阳

（1） 昆明医科大学第二附属医院肿瘤科；2） 肝胆胰外科；3） 胃肠外科，云南昆明 650101；4） 昆明医科大学附属精神卫生中心，云南昆明 650224）

晚期胃肠癌患者极易合并腹膜转移，在其治疗中常常采用化疗，但是化疗药物经常规化疗途径很难在腹腔内有较高浓度，无法对腹腔恶性肿瘤病灶进行有效控制[1-2]。腹腔灌注化疗是治疗恶性肿瘤的一种方法，腹腔灌注化疗可增加药物与腹膜的接触面，提高局部药物浓度，改变腹膜微环境，抑制癌细胞种植[3-5]。但是近年来有文献报道腹腔内持续热灌注化疗的患者认知功能障碍，从而给患者的生活工作带来一些影响[6-7]。也有文献报道把未成年小鼠长期暴露在噪声污染中会使小鼠的认知功能下降[8]，然而腹腔灌注化疗对成年小鼠的认知功能影响却还没有定论。本实验建立小鼠模型，通过短期内对成年小鼠予氟尿嘧啶、顺铂以及丝裂霉素腹腔灌注化疗，评估副反应，探究腹腔灌注化疗药对成年小鼠认知功能的影响，为进一步研究腹腔灌注化疗影响认知功能的分子机制和开发相应药物奠定基础，以期待后续进一步探究腹腔灌注化疗对人的认知功能影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

成年昆明小鼠72 只，昆明洛宇生物有限公司提供。纸箱80 cm×60 cm，4 个，购自昆明群联纸箱厂；BA-200 避暗仪，DT-200 小鼠跳台仪，实验室提供；氟尿嘧啶注射液：上海旭东海普药业有限公司；注射用顺铂，江苏豪森医药股份有限公司；注射用丝裂霉素：浙江海正药业；可移植性小鼠胃癌细胞（MFC）：昆明洛宇生物公司。

1.2 实验方法

成年昆明小鼠72 只，5～6 周龄，每只体重24～30 g，雌雄各半，随机分成四大组，每组18只，每个组再随机分成三小组，每小组6 只小鼠（保持雌雄各半），分别做上标记。用可移植性小鼠胃癌细胞接种于小鼠腹膜，模拟胃癌术后腹膜转移的发生过程。不接受腹腔灌注化疗组，将小鼠在正常环境中饲养，每天给予足量的食物和水，5 d 换一次垫料；氟尿嘧啶腹腔灌注组（5-Fu 组），饲养期间用氟尿嘧啶腹腔灌注化疗，氟尿嘧啶用量为50 mg/kg；顺铂腹腔灌注组（顺铂组），顺铂用量为5 mg/kg；丝裂霉素腹腔灌注组（MMC 组），丝裂霉素用量为5 mg/kg；观察昆明小鼠接受腹腔灌注化疗后的行为学改变。

腹腔灌注化疗过程：先给实验小鼠进行腹腔穿刺置管，后分别将各组药物稀释溶解在10 mL温生理盐水中，经过腹腔引流管将稀释好的药物注入各组小鼠腹腔，然后夹闭腹腔引流管4 h，每隔3 d 进行腹腔灌注一次，共灌注三次。在腹腔灌注化疗实验期间没有小鼠死亡。腹腔灌注化疗结束后3，6，9 d 在各大组中随机抽取一小组进行跳台实验和避暗实验，各测试3 次。

跳台实验：将参加实验的各组昆明小鼠先放入反应箱内适应3 min，后将小鼠放在平台上进行测试，记录小鼠从平台上跳下来的潜伏期（s） 以及5 min 内的错误次数（次），作为小鼠的学习成绩。

避暗实验：正式实验历时2 d，第1 天为获得实验，选择获得模式，设置适应时间为3 min，学习时间为5 min，软件自动检测其错误次数、进入明室的潜伏期；第2 天为巩固实验，在获得实验24 h 后进行，选择巩固模式，软件自动检测其错误次数、进入暗室的潜伏期。将第2 天的错误次数和潜伏期作为小鼠的学习成绩。

1.3 统计学处理

应用SPSS 对重复测量数据进行多元方差分析，并应用GraphPad Prism 8 软件作多线图，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察

接受氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素腹腔灌注化疗后，与未接受腹腔灌注化疗组相比，实验组小鼠在接受腹腔灌注化疗结束的时候均比较惊恐、烦躁，并随着结束时间的延长逐渐表现出活动度减少，反应迟钝。

2.2 避暗实验

实验结果见表1、图1、图2，未接受腹腔灌注化疗组小鼠在第1 次，第2 次和第3 次测试中潜伏期均明显长于5-FU 组、顺铂组、MMC 组（P＜0.05），错误次数明显小于5-FU 组、顺铂组、MMC 组（P＜0.05）。但5-FU 组、顺铂组、MMC组之间潜伏期、错误次数没有统计意义 （P＞0.05），不同天数之间潜伏期、错误次数没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 跳台实验

跳台实验结果见表2、图3、图4，5-FU 组、顺铂组、MMC 组与未接受腹腔灌注化疗组相比出现潜伏期明显缩短（P＜0.05），错误次数明显增多的现象（P＜0.05）。而三个腹腔灌注组之间的潜伏期、错误次数差异无统计学意义（P＞0.05），不同天数之间潜伏期、错误次数差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 避暗实验数据（）Tab.1 The data of the step through test （）

表1 避暗实验数据（）Tab.1 The data of the step through test （）

未接受腹腔灌注化疗组与接受腹腔灌注化疗组比较，*P＜0.05。

图1 避暗实验潜伏期Fig.1 The latency times of the step through test

图2 避暗实验错误次数Fig.2 The error times of the step through test

表2 跳台实验数据（）Tab.2 The data of the platform test （）

表2 跳台实验数据（）Tab.2 The data of the platform test （）

未接受腹腔灌注化疗组与接受腹腔灌注化疗组比较，*P＜0.05。

图3 跳台实验潜伏期Fig.3 The latency times of the platform test

3 讨论

认知功能是大脑的高级功能，是构成智能的要素。可分为获得、巩固及再现3 个基本神经过程。检测认知功能的实验方法有多种，但跳台实验及避暗实验是运用得比较多且经典的检测学习记忆认知功能的方法[9-11]。

图4 跳台实验错误次数Fig.4 The error times of the platform test

化疗药物是一种治疗肿瘤的药物，它杀灭肿瘤细胞的同时也会损伤正常细胞，对于正常细胞来说化疗药物是一种恶性刺激物[12-14]。化疗药物作用于人的中枢神经系统，可使大脑皮层的兴奋和抑制失调，条件反射异常，出现头晕、头痛、耳鸣、多梦、失眠、心慌、记忆力减退、注意力不集中等症状，进而影响大脑的休息运作的调节，导致学习能力与记忆能力等大脑认知功能的下降，严重者可产生精神错乱[15-18]。本实验采用小鼠模型腹腔灌注化疗药物及避暗实验和跳台实验表明，氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素组小鼠的潜伏期比未接受腹腔灌注化疗组显著缩短（P＜0.05）、错误次数增多（P＜0.05），表明氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素的确能降低昆明小鼠的认知功能。但从接受氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素腹腔灌注化疗3 d、6 d、9 d 后小鼠的潜伏期与错误次数的比较来看，未发现随着化疗药物作用时间的延长、认知功能的降低有加重的趋势，提示氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素化疗药物降低认知功能的作用在短期内没有明显的时间依赖性。

在避暗实验中，顺铂组小鼠的潜伏期比氟尿嘧啶组的潜伏期略有缩短，错误次数略有增多，但未有统计意义；而在跳台实验中，顺铂组小鼠潜伏期比氟尿嘧啶组略长，错误次数略多，不能比较两组小鼠认知功能的差异，提示顺铂对认知功能的影响与氟尿嘧啶对认知功能的影响结果差别不大。且丝裂霉素组小鼠的在避暗实验中潜伏期比氟尿嘧啶组和顺铂组缩短，错误次数略有增加，但未有统计意义；而在跳台实验中，丝裂霉素组潜伏期比其他两组略长，错误次数则介于其他两者之间，表明氟尿嘧啶、顺铂及丝裂霉素腹腔灌注化疗对昆明小鼠认知功能的影响未有明显的区别。

总之，本研究发现5-FU、顺铂、MMC 等腹腔灌注化疗可降低昆明小鼠的认知功能，该损害于化疗早期发生至化疗后9 d 未改善或加重。化疗后认知功能损伤近年受到肿瘤学界的广泛重视。充分认识、了解相关机制及干预手段，可以帮助笔者更好的制定治疗方案以及处理副反应，最终提高肿瘤患者的生活质量、改善预后。