GAS6 基因多态性及其血浆水平与昆明地区汉族糖尿病肾脏疾病的相关性

李佳丽，周晓伟，郭伟昌，陈 婕，张 帆，李会芳

（1） 昆明医科大学第一附属医院糖尿病科，云南昆明 650032；2） 朔州市大医院内分泌科，山西朔州 036000；3） 昆明医科大学体育部，云南昆明 650500）

近年来，糖尿病已逐渐成为慢性病、多发病[1]。其中，DKD 是最常见的糖尿病微血管并发症，也是糖尿病患者的主要死因之一[2]。DKD 的发病机制较复杂，主要与血糖长期控制不佳致机体出现的氧化应激有关，T2DM 会使患者出现自身免疫反应及低度慢性的临床炎性反应，从而导致DKD 的发生与发展[3]。目前，临床上多用尿微量白蛋白、尿白蛋白肌酐比值等指标早期诊断DKD，但这些指标受影响的因素较多[4]，因此，寻找诊断DKD 的新型生物标志物对于早期预防疾病有重要的意义。

研究表明[5]，DKD 患者普遍存在炎性细胞浸润、炎症因子水平上升等表现。GAS6 是属于维生素K 依赖蛋白家族的一种分泌蛋白，参与炎症反应过程[6]。Hung 等[7]证实在新发糖尿病患者中，血浆GAS6 水平与血糖水平、炎症、内皮功能异常标志物呈负相关。GAS6 不仅与糖尿病发生相关，更有研究证实[8]，GAS6 在DKD 的初始阶段也发挥重要作用。GAS6 可与Axl（受体酪氨酸激酶） 结合，促进P27 的表达，P27 是细胞周期的调节因子之一，能诱导G1 期细胞周期停滞，导致肾小球系膜细胞肥大，促使DKD 发生、发展[9]。Arai 等[10]在GAS6 基因敲除小鼠体内发现肾小球的肥大程度有所减轻。Yanagita 等[11]的研究明确，华法林可抑制GAS6 及其受体Axl 的表达，从而减轻肾小球系膜细胞的肥大并改善肾小球的超滤状态，从而抑制蛋白尿的产生。鲁伟等[12]通过比较微量白蛋白尿的T2DM 患者、正常白蛋白尿的T2DM 患者以及健康者的血浆GAS6 水平，发现微量白蛋白尿组血浆GAS6 水平高于正常白蛋白尿组及健康者，差异具有统计学意义，且血浆GAS6 水平与24 h 尿微量白蛋白及HbA1c 水平均呈正相关，而正常白蛋白尿组与健康者的血浆GAS6 水平无统计学差异。在聂明明等[13]的研究中，DKD 组血浆GAS6 水平与总胆红素（TBIL） 水平、间接胆红素（IBIL） 水平均高于对照组，差异有统计学意义，提示GAS6 水平与DKD 的发生有关。这一系列相关研究提示，GAS6 在DKD 的发生中起到重要作用。本研究旨在探讨GAS6 基因多态性及其血浆水平与昆明地区汉族人群糖尿病肾脏疾病的发生、发展是否具有相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取血糖正常的NC 组成员186例，其中女85例，男101例，均为在昆明医科大学第一附属医院体检中心体检过的健康对照者，年龄（51.90±5.27） 岁，空腹血糖≤5.6 mmol/L；T2DM 组由225例2017年9月至2018年1月在昆明医科大学第一附属医院就诊的2 型糖尿病患者组成，女110例，男115例，均符合1999年WHO 制定的糖尿病诊断标准，且临床未诊断为DKD，年龄均在40 岁至55 岁之间；选取在昆明医科大学第一附属医院确诊为糖尿病肾脏疾病（DKD 组） 患者127例，其中男63例，女64例，纳入标准：符合单纯2 型糖尿病组（T2DM 组） 纳入标准且尿白蛋白肌酐比值＞30 mg/g 或24 h 尿白蛋白排泄率＞30 mg/24 h，并排除其他可能导致尿白蛋白排泄增加的原因和肾脏疾病，年龄均在40～55 岁。研究对象均已知情同意。

1.2 研究方法

使用DNA 抽提试剂盒提取所有样本的DNA，并按文献报道合成引物。

单核苷酸多态性（rs8191974），上游序列（5’-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3’），下游序列（5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3’）。

PCR 反应体系：1 μL DNA 模板，上下游引物共2 μL，2X Tap PCR Master Mix 12.5 μL，加dH2O 9.5 μL至总体积25 μL，进行聚合酶链反应（PCR）扩增：预变性处理，95℃5 min，单循环；变性处理30 s，55℃；退火处理30 s；延伸处理72℃40 s；终末延伸处理7 min，整体35 个循环。最后由上海生物工程有限公司进行Sanger 测序，测定所有样本GAS6 基因rs8191974 位点的基因多态性。ELISA 法测定血浆Gas6 含量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 三组间临床指标和GAS6 水平比较

DKD 组的SBP 和TG 均高于NC 组和T2DM 组（P＜0.017），差异有统计学意义；DKD 组的病程、BMI、DBP、TC、LDL、FBG 均高于NC 组，但是HDL 要低于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.017）；DKD 组UACR 和HbA1c 水 平 均 高 于T2DM 组，差异有统计学意义（P＜0.017）；T2DM组病程、BMI、SBP、DBP、TG、LDL、FBG 均要比NC 组组，HDL 水平比NC 组低，差异有统计学意义（P＜0.017）；DKD 组及T2DM 组的GAS6 水平均低于NC 组，差异均有统计学意义（P＜0.017）；而GAS6 水平在DKD 组与T2DM 组间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

与NC 组比较，*P ＜0.05；与T2DM 组比较，△P ＜0.05。

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

与NC 组比较，*P ＜0.05；与T2DM 组比较，△P ＜0.05。

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

表1 三组的GAS6 水平及各项指标的比较（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

与NC 组比较，*P ＜0.05；与T2DM 组比较，△P ＜0.05。

2.2 各组间GAS6 基因rs8191974 位点基因型和等位基因频率比较

GAS6 基因rs8191974 位点多态性测序图，箭头所示基因型分别为GG、GA、AA（见图1～图3）。

2.3 各组样本的Hardy-Weinberg 平衡检验

各组样本的GAS6 基因rs8191974 位点基因型频率均与Hardy-Weinberg 遗传定律一致（P＞0.05）。其中，G、A 等位基因频率分别为0.78、0.22，见表2。

2.4 各组间GAS6 基因rs8191974 位点基因型频率比较

用R×C 表χ2检验比较三组间GAS6 基因rs8191974 位点基因型频率，有统计学差异（χ2=12.122，P=0.016）。再拆分为2×C 表做χ2检验，最后进行两两比较，α’=0.05/3=0.017。两两比较结果显示，T2DM 组的GA、AA 基因型频率低于NC 组，GG 基因型频率却比NC 组高，存在统计学差异（χ2=10.779，P=0.005）；DKD组与NC 组及T2DM 组的基因型频率均无统计学差异（χ2=25.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），见表3、表4。

2.5 各组间GAS6 基因rs8191974 位点等位基因频率比较

用R×C 表χ2检验将各组rs8191974 位点的等位基因频率对比，差异显著（χ2=11.633，P=0.003）。进一步拆分为2×C 表做χ2检验进行两两比较，α’=0.05/3=0.017。结果显示，NC 组的A 等位基因频率要大于T2DM 组，而G 等位基因频率要小于T2DM 组，差异显著（χ2=10.701，P=0.001）；DKD 组与NC 组、T2DM 组间的等位基因频率的差异均不显著（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），见表5、表6。

2.6 糖尿病肾脏疾病相关因素的Logistic 回归分析

将糖尿病肾脏疾病与否定为因变量（未诊断=0，诊断=1），自变量包含性别（男性=1，女性=2）、年龄、T2DM 病程、HBP 病程、吸烟史（无=0，有=1）、饮 酒 史（无=0，有=1）、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL、HDL、FBG、GAS6基因rs8191974 基因型（GG=1，GA=2，AA=3），行Logistic 回归分析后发现HBP 病程、SBP 和FBG可能是糖尿病肾脏疾病发生的危险因素，但是GAS6 基因rs8191974 多态性及其血浆水平可能与糖尿病肾脏疾病的发生无相关性，见表7。

图1 GG 基因型Fig.1 GG genotype

图2 GA 基因型Fig.2 GA genotype

图3 AA 基因型Fig.3 A genotype

表2 各组样本的Hardy-Weinberg 平衡检验［n（%）］Tab.2 He Hardy-Weinberg blance test in samples from the three groups ［n（%）］

表3 rs8191974 位点基因型频率比较［n（%）］Tab.3 Cmparisons of genotype frequency of rs8191974 ［n（%）］

表4 rs8191974 位点基因型频率的两两比较Tab.4 Pairwise comparisons of genotype frequency of rs8191974 locus

表5 rs8191974 位点等位基因频率的比较［n（%）］Tab.5 Comparisons of allele frequency of rs8191974 ［n（%）］

表6 rs8191974 位点等位基因频率的两两比较Tab.6 Pairwise comparison of allele frequency of rs8191974

表7 相关危险因素的Logistic 回归分析Tab.7 Logistic regression analysis of the risk factors

3 讨论

糖尿病肾脏疾病是常见的糖尿病慢性并发症，表现为肾小球滤过率减小以及持续白蛋白尿，病情早期还可能会出现肾脏高滤过、肾小球肥大以及系膜细胞增殖等变化。已有研究明确，GAS6 来自小鼠肾小球系膜细胞，是一种生长因子。它能作为内源性的有丝分裂原，引起系膜细胞的大规模增殖[14]。Naga 等[8]的研究发现，在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内，肾小球内皮细胞及系膜细胞GAS6及其Axl 表达量明显增加。而GAS6 及其Axl 表达量的增加，会通过Akt/mTOR 途径上调P27 的表达，P27 是细胞周期的调节因子之一，能诱导G1期细胞周期停滞，最终引起肾小球肥大[9]。若GAS6 基因被敲除，小鼠Akt 活性则减低，进而减轻肾小球肥大程度[10]。Yanagita 等[11]的研究明确，华法林可抑制GAS6 及其受体Axl 的表达，从而减轻肾小球系膜细胞的肥大并改善肾小球的超滤状态，从而抑制蛋白尿的产生。这一系列相关研究提示，GAS6/Axl 信号传导通路在DKD 发生中起到重要作用，若抑制该信号通路，就能够延缓糖尿病肾脏疾病的进展，从而改善病人生活质量。

本研究发现，DKD 组、NC 组及T2DM 组相比，GAS6 基因rs8191974 位点GG、GA 及AA 基因型频率的分布无统计学差异（χ2=5.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），并且等位基因频率在各组间也无统计学差异（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），所得研究结果与Erkoc 等[15]相同，推测GAS6 rs8191974 位点基因多态性与DKD 可能不存在相关性。Li 等[16]研究GAS6 的血浆浓度会与糖尿病及糖尿病肾脏疾病严重程度平行，从而推测出血浆中GAS6 的含量也许与蛋白尿的产生负相关，并提出在早期诊断DKD 时，GAS6 可能是非侵入性生物标志物较好的选择，而Erek-Toprak 等[17]推测血浆GAS6 含量与T2DM 患者尿白蛋白水平呈正相关关系，提出较高水平的血浆GAS6 含量可能会使糖尿病肾脏疾病风险有不同程度的增加。本研究结果显示，T2DM 组及DKD 组血浆GAS6 水平均低于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），但是这两组间的血浆GAS6 水平不存在显著性差异，由此推测出血浆GAS6 水平可能与T2DM 的发生有关而与DKD 的发生无关。而这与Li[8]和Erek-Toprak 等[9]的结果不一致，可能是遗传异质性、地域差异以及种族差异带来的影响。

在本研究中，昆明地区的汉族人群中，GAS6基因rs8191974 位点基因多态性及其血浆水平与糖尿病肾脏疾病可能不存在相关性，也可能与样本量较小，差异性难以显现有关，有待后续扩大样本量进一步深入研究。