三种常见CD36基因突变体标准质粒的构建*

陈尚良，刘正婷，黄佳丽，何海洪，黎绍昌，李立浩

南方医科大学深圳医院，广东深圳 518000

高分辨率熔解曲线分析方法因具有操作简便、速度快、通量大、成本低、不受检测位点局限，既可以检测已知突变又可发现未知突变等优点，已经在多个领域中得到了广泛的应用。本研究拟建立高分辨率熔解曲线分析方法，对常见的CD36基因突变进行筛查。然而，无论使用何种方法，通常需要已确认的DNA样品对建立的方法进行评价和质量控制，但由于DNA样品本身的限制性，其作为大规模筛查的标准品有其自身不足之处，因此需要克隆相应的质粒作为标准品。本研究首先利用重叠延伸PCR定点突变的方法获取CD36基因突变片段，然后通过TA克隆技术分别构建含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变片段的野生型和纯合突变型质粒，为后续建立高分辨率熔解曲线分析(HRM)方法筛查CD36基因多态性奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1材料 DNA提取酚试剂(北京索莱宝公司，货号：T0250)、核酸抽提试剂(24∶1北京索莱宝公司，货号：P1014)、3M乙酸钠(北京索莱宝公司，货号：A1070)、X-gal (北京索莱宝公司，货号：X1010)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(北京索莱宝公司，货号：I8070)、DNA Marker(北京索莱宝公司，货号：M1100)均购自广州昂飞生物公司、克隆菌E.coli DH5α 感受态细胞 (Taraka，货号：9057)、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，货号：R010A)、Takara Ex Taq®DNA Polymerase(Takara，货号：RR001Q)、pMD19-T Vector Cloning Kit(Takara,货号：6013)均购自广州瑞真公司，质粒小提试剂盒(Magen，货号：D2110-02)均购自广州美基生物公司。

1.2方法

1.2.1人血基因组DNA提取 健康人乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝外周全血来源于南方医科大学深圳医院输血科。取1 mL全血样本，采用酚氯仿法提取外周血基因组DNA，具体方法详见产品说明书。最后用30 μL TE缓冲液溶解血基因组DNA，置于-20 ℃冻存备用。

1.2.2PCR引物设计 基于重叠延伸PCR定点突变的原理，使用Primer3 Plus引物设计网站设计针对CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变的引物，每个突变位点共4条引物，见表1。F和R分别代表侧翼上游和下游引物，用于扩增含突变位点的全长片段。Fm和Rm为引入突变位点的突变上游和下游引物，并且部分序列重叠互补，与侧翼引物配对扩增含有突变位点的上、下游序列。

表1 引物序列

注：下划线表示碱基替换或缺失位点。

1.2.3重叠延伸PCR定点突变方法原理 重叠延伸PCR定点突变是通过2轮PCR扩增来完成的。第1轮PCR以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，以侧翼上游和突变下游为引物，在高保真酶的作用下进行PCR扩增获得含有突变位点的上游序列。同时，以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，以侧翼下游和突变上游为引物，在高保真酶作用下进行PCR扩增，获得含有突变位点的下游序列。这两个反应同时进行，最后获得含有重叠片段的PCR产物，将其经过切胶回收纯化后，等浓度、等量混合。第2轮PCR扩增以上述混合PCR产物为模板，以侧翼上游引物和侧翼下游引物为模板，在Taq酶作用下进行PCR扩增，获得含有突变位点的全长片段。同样以健康人血基因组DNA为模板，侧翼上游引物和侧翼下游引物为引物，在Taq酶作用下进行PCR扩增，获取野生型片段。

1.2.4PCR扩增

1.2.4.1第1轮PCR扩增 以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，引物F与Rm、Fm与R搭配，在高保真酶的作用下进行PCR扩增。反应体系为50 μL：0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)，4 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L each)，10 μL 5 × PrimeSTAR buffer(Mg2+Plus)，1 μL引物(5 pmol)，200 ng模板，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR扩增条件：98 ℃变性10 s， 55 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 min，共40个循环。最后置于4 ℃保存30 min。

1.2.4.2第2轮PCR扩增 将第1轮PCR产物进行切胶，回收纯化，具体按照试剂盒说明书操作。将纯化后的PCR产物按照相同浓度混合作为第2轮PCR扩增的模板，F与R为引物，在Taq酶作用下进行第2轮PCR扩增。反应体系为50 μL：0.25 μL Takara Ex Taq®DNA Polymerase(5 U/μL)，4 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L each)，1 μL引物(0.2 μmol/L)，200 ng模板，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR扩增条件：98 ℃变性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。最后置于4 ℃保存30 min。

1.2.5TA克隆 将第2轮PCR产物用DNA纯化试剂盒切胶回收纯化，纯化后的PCR产物作为TA克隆的模板，将目的基因片段与pMD19-T Vector连接，连接反应体系为5 μL，包括1 μL pMD19-T Vector，0.1～0.3 pmol的PCR产物，加灭菌双蒸水补足至5 μL。具体操作详见说明书。最后将反应产物导入E.coli DH5α 感受态细胞，然后涂布于含有X-gal、异丙基硫代半乳糖苷(IPIG)、氨苄青霉素(Amp)的平板中37 ℃过夜培养。

1.2.6质粒提取 挑取单个白色菌落于5 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37 ℃振荡培养12 h，取2 mL菌液用于质粒提取采用质粒抽提试剂盒进行质粒提取，具体操作详见说明书。剩下的菌液用15%甘油保种。

1.2.7DNA测序 将菌液和重组质粒送上海生工生物有限公司广州分公司进行序列测定，以验证是否成功克隆。结果用SeqMan软件及NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST 分析。

2 结 果

2.1第1轮PCR扩增产物电泳结果 1.5%琼脂糖电泳结果显示：泳道1、4、7分别是3种突变的CD36基因野生型片段，PCR产物条带大小分别为372、253、489 bp；泳道2和3分别是含有A1237C突变的上游序列和下游序列，PCR产物条带大小分别为233、156 bp；泳道5和6分别是含有C268T突变的上游序列和下游序列，PCR产物条带大小分别为115、112 bp；泳道8和9分别是含有329-330delAC突变的上游序列和下游序列，PCR产物条带大小分别为235、267 bp。见图1。

2.2第2轮PCR产物电泳结果 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示：含有CD36基因A1237C突变的全长片段大小是372 bp，含有CD36基因C268T突变的全长片段大小是253 bp；含有CD36基因329-330delAC突变的全长片段大小是487 bp。见图2。

2.3重组质粒的DNA测序结果 将菌液和重组质粒进行DNA测序鉴定，并且在NCBI网站上使用BLAST进行序列比对。测序结果显示，重组质粒pMD19-1237CD36基因1237处的碱基由A突变为C，其余序列和野生型序列相同；重组质粒pMD19-268268处碱基由C突变为T，其余序列同野生型；重组质粒pMD19-329-330的329-330处缺失两个碱基A和C。由此可见，成功构建了上述3个常见CD36基因突变的质粒。

注：M为DNA marker；泳道1、4、7为CD36基因野生型PCR产物；泳道2、5、8为含有A1237C、C268T、329-330delAC上游序列PCR产物；泳道3、6、9为含有A1237C、C268T、329-330delAC下游序列PCR产物。

图1 第1轮PCR产物以及野生型PCR产物电泳图

注：M为DNA marker；泳道1～4为A1237C突变基因片段PCR产物；泳道5～8为C268T突变基因片段PCR产物；泳道9～10为329-330delAC突变片段PCR产物。

图2 第2轮PCR产物电泳图

3 讨 论

CD36亦称血小板膜糖蛋白Ⅳ(GPⅣ)或NaKa抗原，是一种相对分子质量约为88 000的糖基化蛋白，属于B类清道夫受体家族，其广泛分布于血小板、单核细胞、巨噬细胞、红细胞前体细胞及毛细血管内皮细胞等多种细胞表面[1]。CD36缺失分为两种类型：Ⅰ型缺失是血小板和单核细胞均缺乏CD36抗原，而Ⅱ型缺失仅是血小板缺乏CD36抗原。通常仅Ⅰ型缺失即可导致同种免疫性血小板减少症的发生。有研究报道，Ⅰ型CD36缺失的发生是由CD36基因杂合突变或者纯合突变所致，最常见的突变是C268T、949insA及329-330delAC[2]。CD36基因多态性在不同国家和地区，不同人群之间存在明显差异，亚洲人群CD36基因突变主要是C268T，占所有突变的50%以上[3]，国内学者报道中国CD36基因突变主要是329-330delAC[4]。

随着分子诊断技术的不断发展，现阶段筛查CD36基因多态性的方法主要有实时PCR、直接测序法、聚合酶链反应-限制性酶长度多态性分析(PCR-RFLP)、序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)[5-7]等，但是上述方法均存在操作烦琐、耗时长、容易产生PCR产物污染等缺点，不适于临床大规模应用。HRM方法是最近兴起的用于基因突变扫描和基因分型的分子诊断技术，由于该方法具有成本低、灵敏度高、PCR污染小等优点，被广泛应用于珠蛋白生成障碍性贫血基因突变的筛查[8]、结核分枝杆菌耐药基因筛查[9]、肿瘤基因突变及甲基化筛查[10]等。

基于HRM方法的特性，本研究拟建立一种HRM技术检测CD36基因多态性的方法。在建立该方法的过程中，需要提供已确认的DNA样品对方法进行评价，以及质量控制等，然而，由于DNA样品本身的特性，其作为大规模筛查的标准品存在一定的局限性，因此需要克隆相应的质粒作为标准品。本研究采用重叠延伸PCR突变方法人为地进行碱基的改变，获取目的突变基因片段，再通过TA克隆技术构建含有目的片段的野生型和纯合突变型质粒，为HRM方法筛查CD36基因多态性提供基因型标准品。

目前用于PCR定点突变的技术有很多，甚至有些公司研发了相关的商品化试剂盒，例如Takara公司的多点突变试剂盒、天根公司的快速定点突变试剂盒等，然而这些试剂盒成本较高，不宜作为实验室首选的定点突变方法。重叠延伸PCR技术是一种高效、经济的突变方法，该方法可对DNA片段中间区域的碱基进行人为的突变，包括碱基的插入、缺失、替换等。基于重叠延伸PCR方法的原理，本研究设计了针对CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变的引物，包括用于扩增全长的侧翼引物，并且对引物引入了突变位点，用于扩增包含突变位点及其上、下游序列，通过2轮PCR和3个反应来获得突变片段。为了防止PCR扩增过程中发生碱基错配，在第1轮PCR扩增采用了高保真酶，该酶扩增效率高，还具有3′-5′核酸外切酶的活性，可以在PCR扩增过程中切除错配的碱基，从而提高PCR扩增的保真性。而第2轮PCR则使用Taq酶进行扩增，在扩增结束后可在PCR产物末端加A，反应产物可以直接和T载体连接，进行TA克隆。为了验证质粒是否构建成功，本研究还对重组质粒进行DNA测序分析验证，测序结果表明，成功将CD36基因1237位点处碱基由A突变成C，268位点处碱基由C突变成T，329位点处缺失A、C两个碱基。

综上所述，本研究成功构建了3种常见CD36基因突变体标准质粒，为后续建立HRM技术检测CD36基因多态性提供了基因分型对照。