牡蛎肽酸奶工艺及体外抗氧化活性研究

戴梓茹，吴远清，张晨晓，梁东萍，覃柳英

（1.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西钦州535011；2.北部湾大学食品工程学院，广西钦州535011）

0 引 言

牡蛎是北部湾重要的海产资源，它肉质鲜美爽滑、营养丰富，有“海洋牛奶”的美称。牡蛎中的必需氨基酸完全程度和质量比例优于牛乳和人乳[1]。益生菌不仅在人体肠道内起着营养、激活免疫及抗感染、能减少食物过敏[2]，抗高血压[3]，而且还具有抗过敏[4]、抗肿瘤[5]、抑制致病菌[6]，防治消化性溃疡和改善酒精性脂肪肝等多种益生效果[7]。牡蛎多肽具有一系列生物功能，卢学敏等[8]研究发现牡蛎中含有一些活性肽对副溶血性弧菌、枯草芽孢杆菌等具有一定的抑制作用。Lee 等[9]酶解太平洋牡蛎并得到两个具有HIV-1蛋白酶抑制活性的六肽。同时，牡蛎肽具有良好的抗氧化性，是一种天然的抗氧化剂，并含有重要的抗癌药物的组分[10]；牡蛎肽还具有增强小鼠免疫力、游泳耐受力等良好的保健效果[11-12]。

广西北部湾牡蛎资源丰富，但本地缺乏牡蛎深加工企业以及相关加工技术，使得北部湾处于整个牡蛎产业链的原料端，产业产品的附加值低，致使产业技术升级艰难，因此，促进牡蛎和牡蛎产品多样化开发，提高产业效益迫在眉睫。本文采用响应曲面法优化牡蛎多肽酸奶制备工艺，研制出的酸奶产品酸甜适中，口感较好，为牡蛎的高值化开发利用提供了可靠的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡蛎肽粉，北部湾大学食品工程学院实验室制备保存；德氏乳杆菌德氏亚种-保加利亚菌、嗜热链球菌种、副干酪乳杆菌种均为中国科学微生物研究所保藏；全脂奶粉，纽瑞滋上海食品有限公司；脱脂奶粉，恒天然商贸上海有限公司；精制白砂糖，柳州市柳冰食品厂；海藻酸钠，思远生物科技；活性炭粉末状食品级，海星供水网上店；一水柠檬酸食品级，湖北鑫润德化工有限公司；0233 培养基，006 培养基，CGMCC 建议培养基；MRS 培养基，BR 培养基：北京陆桥技术有限责任公司；NaCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司；NaOH，HCl，国药集团化学试剂有限公司；酚酞，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；酒精，新泰市润生医疗卫生用品有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程图

1.2.2 脱腥处理

采用了叶盛权[13]等人的方法，用0.5%活性炭量，调节pH 等于7.0、在恒温水浴锅30 ℃条件下吸附保温0.5 h，过滤，滤液待用。

1.2.3 菌种的恢复培养

（1）恢复培养：移取4 mL 液体培养基至安瓿瓶内，轻震，使冻干菌粉形成悬浮液，移取2 mL 悬浮液于10 mL 的培养基管中，置于37 ℃培养下培养至培养液出现浑浊或有沉淀状态，培养时间为20～43 h。

（2）扩大培养：将恢复培养的菌种进行扩大培养，培养时间为12～36 h。

（3）凝乳实验：配置浓度为10%的牛奶培养基，接种量为1.5%，培养至凝乳，牛奶凝固后，即为需要的发酵益生菌母菌种。

1.2.4 牡蛎肽酸奶制备工艺优化

1.2.4.1 单因素实验

以牡蛎多肽酸奶的感官评分为评价指标，考察菌种（菌种保加利亚菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌）、菌种比例、菌种接种量、牡蛎肽添加量、白砂糖添加量、增稠剂（海藻酸钠）添加量、发酵时间、奶粉添加量对产品感官品质的影响。

1.2.4.2 响应曲面设计优化酸奶配方

根据单因素试验结果，选取影响较大的4 个因素进行响应面设计。即选用牡蛎肽添加量、菌种接种量、白砂糖添加量、发酵时间作为影响因素，以感官评价为指标，利用design-expert8.0.6trial 软件，利用Box-Behnken 设计原理设计响应面优化方案。响应面试验因素水平如表1 所示，感官评分标准如表2 所示。

表2 感官评分标准

1.2.5 理化指标及微生物指标测定

根据GB/T4789.35-2016测定乳酸菌[14]。

根据GB 4789.2-2016测定菌落总数[15]。

根据NaOH 滴定法测定酸度。

根据过量水方法测定持水力。

pH 计测量 pH 值。

1.2.6 牡蛎肽酸奶抗氧化活性测定

1.2.6.1 样液制备

参考文献[16-17]并根据实际对实验方法进行修改，称取发酵8 h 后的酸奶5.0 g，以40%甲醇为提取液，超声1 h 后过45 μm 有机膜，即可提取出酸奶中的抗氧化活性物质，备用。

1.2.6.2 还原力测定

采用铁氰化钾法检测还原力，取按1.2.6.1 所制备的提取物1.0 mL，先后向其中加入pH 6.6 2.5 mL 的磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，置于50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL10% TCA 以及0.5 mL0.1%氯化铁，混匀静置10 min，于700 nm 测吸光值，以超纯水为空白，吸光值越高，表明抗氧化效果越好。

1.2.6.3 DPPH 清除率测定

取按1.2.6.1 所制备的提取物5.0 mL，向其中加入5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，避光室温反应30 min，于 517 nm 处测其吸光值为 As，Ao 为 5.0 mL 蒸馏水与5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合物于517 nm 处所测吸光值，Ac 为按1.2.6.1 所制备的提取物5.0 mL 与5.0 mL 乙醇混合后于517 nm 处所测吸光值，计算公式为：

2 结果与分析

2.1 单因素对牡蛎肽酸奶感官评分的影响

选择菌种种类、菌种配比、菌种接种量、牡蛎肽添加量、白砂糖添加量及发酵时间作为单因素，考察其对牡蛎肽酸奶感官评分的影响，结果如图1 所示。结合3 种菌种对牡蛎多肽酸奶感官评分，考虑酸奶的较适宜的pH 范围（4.0～5.0）[18]，选择嗜热链球菌、保加利亚菌进行联合发酵（图1a）。嗜热链球菌：保加利亚菌种比例为3∶1 时，感官评分最高，此时产品pH 为4.50，牡蛎肽酸奶酸甜可口，组织状态较好（图1b）。菌种接种量为3.0% 时，感官评分最高，为82.6 分，此时，牡蛎肽酸奶的pH 稳定，酸甜可口，口感细腻，无异味（图1c）。当牡蛎肽添加量为0.3 g/100 mL 时，感官评分最高，pH 为4.67，具有牡蛎产品特有的香味，风味物质形成良好，酸甜适中，口感细腻，无异味（图1d）。白砂糖添加量为7.0% 时，感官评分最高，pH 为4.71，产品无酸涩甜腻感（图1e）。当发酵时间为7.0 h 时，感官评分最高，pH 为4.45，酸奶组织状态好，口感酸甜可口。因此，选择发酵时间为7.0 h（图1f）。综上，选择嗜热链球菌、保加利亚菌进行联合发酵，各因素的最适量分别为菌种配比3∶1、菌种接种量3.0%、牡蛎肽添加量0.3 g/100 mL、白砂糖添加量7.0%、发酵时间7 h。

图1 单因素对牡蛎肽酸奶感官评分的影响

2.2. 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验评分结果

以牡蛎肽添加量、菌种接种量、白砂糖添加量、发酵时间作为影响因素，以感官评分为指标，利用design-expert8.0.6 trial 软件设计的响应面优化进行试验，得出感官评分如表3所示。

采用design-expert8.0.6trial 软件进行响应面分析后，可得以下方程模型：

Y=83.64-0.47A+0.29B-0.21C+1.44D+(2.5×10-3)AB-1.46AC+(2.5×10-3)AD+0.000BC+0.047BD-(2.5×10-3)CD-1.60A2-0.34B2-1.22C2-0.37D2

由表4 可以看出，依据P值的大小可以知道显著性的差异，P值越小显著性越高，模型P＜0.0001 表明该模型极其显著。失拟项P=0.54045＞F=0.05，表示方程模拟的失拟项不显著，方程拟合程度较高，实验可信。P值＜F值时，该项具有显著的影响，其中AB，AD，BC，BD，CD 项P＞0.05，说明这四项为不显著项，表明了A 与B，A 与D，B 与C，B 与D，C 与D 之间的交互作用不明显，AC 项P＜0.05，表明AC 之间具有显著交互作用，依据P值可以知道，各因素对感官评分的影响顺序为是：C＞B＞A＞D。

2.2.2 响应曲面分析

表3 响应面试验感官评分结果

利用Design-Expert 8.0.6 软件分析得出等高线图以及响应曲面图，同一个区域表示响应值一致，等高线形成椭圆越密集，以及响应曲面图弯曲度越高，皆可表明因素间交互作用越显著。图2-图7 是各因素间交互作用的等高线图和响应曲面图。

由图2 等高线形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的弯曲程度可知，菌种接种量与发酵时间交互影响不显著。菌种接种量在2.5%～3.0%，发酵时间在6.5～7.0 h时，感官评分最高。

图2 菌种接种量和发酵时间的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

表4 方差分析

图3 菌种接种量和白砂糖添加量的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

由图3 等高线图形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的陡峭程度可知，菌种接种量与白砂糖添加量交互影响显著。菌种接种量为2.5%～3.0%，白砂糖添加量为6.5%～7%时，感官评分最高。

图4 菌种接种量和牡蛎肽添加量的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

由图4 等高线图形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的陡峭程度可知，菌种接种量与牡蛎肽添加量交互影响不显著。菌种接种量为2.5%～3.0%，牡蛎肽添加量为0.3%～0.35% 时，感官评分最高。

图5 发酵时间和白砂糖添加量的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

由图5 等高线图形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的陡峭程度可知，发酵时间与白砂糖添加量交互影响不显著。发酵时间为7%～7.5%，白砂糖添加量为7%～7.5% 时，感官评分最高。

图6 发酵时间和牡蛎肽添加量的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

由图6 等高线图形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的陡峭程度可知，发酵时间与牡蛎肽添加量交互影响不显著。发酵时间为6.5%～7%，牡蛎肽添加量为0.25%～3%时，感官评分最高。

图7 白砂糖添加量和牡蛎肽添加量的交互作用对牡蛎肽酸奶感官评分影响的响应曲面图

由图7 等高线图形成椭圆的密集程度以及响应曲面图的陡峭程度可知，白砂糖添加量与牡蛎肽添加量交互影响不显著。白砂糖添加量为7%～7.5%，牡蛎肽添加量为0.25%～0.3%时，感官评分最高。

响应曲面图呈上凸形态，表明回归模型存在最大值，利用Design-Expert8.0.6 软件在牡蛎酸奶基础配方上进行优化，可得菌种接种量、发酵时间、白砂糖添加量、牡蛎肽添加量四个考察因素的最佳值分别为3.47%、8 h、7.69%、0.37 g/100mL，感官评分预期值为81.432，同时进行验证实验，实际感官评分为83.9，高于预测值，由此说明配方优化是可靠有效的。

2.3理化指标和微生物指标测定结果

表5 牡蛎多肽酸奶理化指标及微生物指标

由表5 可知，试验结果符合国家相关标准，pH 值4.02在特定范围内，持水力70%。

2.4 牡蛎多肽酸奶抗氧化能力研究

总还原力的检测原理[19]主要是依据Fe3+-Fe2+之间的相互转化，从而证明样品是否具有抗氧化性。DPPH 清除自由基作用机理主要是通过加入抗氧化剂前后吸光值的变化计算出自由基清除率[20]。通过调查发现，发酵乳酸菌中会产生某种具有清除自由基能力的微生物[21-22]，牡蛎多肽中也含有能清除自由基的活性物质，故而两者的复合使用，将会产生增效作用，使得产品的抗氧化活性增强。本研究通过测定总还原力和DPPH 自由基清除率探讨牡蛎多肽酸奶的抗氧化能力，结果如图8 和图9 所示。随着样品浓度的逐渐增加，牡蛎多肽酸奶吸光值逐渐上升，当浓度为50 mg/mL 时可达0.257；酸奶对照则在样品浓度为45 mg/mL 达到最高值 0.186，当浓度为 50 mg/mL 时，吸光值开始下降；将牡蛎酸奶与酸奶对照的DPPH 自由基清除率相比较，牡蛎酸奶的清除率高于酸奶对照，牡蛎酸奶的清除率可高达25.90%，酸奶对照为18.93%，从而可知牡蛎酸奶具有一定的抗氧化活性,在一定程度上提高了牡蛎肽酸奶的附加值。

图8 总还原力

图9 DPPH清除率

3 结 论

以感官评分为考核指标，采用单因素和响应曲面设计优化牡蛎酸奶工艺，并对产品理化指标、微生物指标及抗氧化指标进行分析。结果表明，牡蛎酸奶最优配方为菌种添加量3.47%，发酵时间8 h，糖添加量7.69%，牡蛎添加量0.37 g/100 mL，在此工艺下感官评分最高，

为83.90 分；制成牡蛎酸奶的乳酸菌总数为1.7×107cfu/mL，pH 值为4.02，滴定酸度为113 °T，持水力为70%，符合国家相关标准要求；牡蛎肽酸奶总还原力为0.257，DPPH 自由基清除率为25.90%，抗氧化能力显著高于对照组，说明牡蛎肽酸奶有效提高了酸奶的抗氧化能力。该工艺下的产品呈乳白色，色泽均匀，有光泽，香味协调，有发酵乳固有香味，组织细腻均匀无气泡，有酸牛奶固有滋味，酸甜可口。此牡蛎酸奶配方能较好满足感官和生产所需，同时为牡蛎的深加工利用提供更好的参考依据。