头针对MPTP诱导的PD小鼠行为学及PI3K、p-Akt (Ser473)蛋白表达的影响

李全,尹洪娜,孙忠人,于楠楠*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

帕金森病(PD)为最为常见的神经系统变性疾病之一，具有高发病率、高致残率的特点，严重影响着患者的日常生活能力及生存质量[1-3]。目前，药物治疗PD在一定程度上可以控制患者病情、缓解临床症状和延缓疾病进程，但长期服用极易出现各种毒副作用以及并发症。因此，从毒副作用更小、疗效更为显著的层面探索PD治疗新方法迫在眉睫。本实验旨在基于PI3K/AKT信号通路，从动物实验角度研究头针治疗PD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物的选择及分组

10～11周龄雄性C57BL/6小鼠50只,体质量(20±2)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(黑)2013004)。置于室温(20～24 ℃)，自由饮水、取食，适应性喂养1周后开始建模。建模成功后，随机选择10只小鼠标记为正常组(control group)，其余30只小鼠建模成功后随机分为模型组(model group)、针刺组(BMA group)和美多巴组(Madopar group)，每组各10只。

1.2 实验药物

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP,美国Sigma公司)；美多芭 (madopar,上海罗氏制药有限公司，规格为0.25 g/片，生产批号：H10930198)。

1.3 模型制备

MPTP为最常用的PD动物模型诱导建模方法[4]，为提高模型存活率，参考相关文献[5]，选用慢速模型制模方法，即每日9:00时对模型组、针刺组和美多芭组小鼠行MPTP腹腔注射，浓度为3 mg/mL(含有MPTP 0.3 mg)，日1次，连续7 d。

1.4 干预方法

实验第8 d开始(即动物模型建立后)，每日上午9:00 AM对各组小鼠进行相应干预。

针刺组小鼠参照《实验针灸学》[6]提供的方法，定位大鼠腧穴，局部脱毛、龙胆紫定标，使用0.35 mm×40 mm毫针(贵州安迪医疗器械有限公司，批号：20190715)针刺百会、宁神、舞蹈震颤区(双侧)及风池(双侧)，百会、宁神施以重复捻转手法，捻转5 min后休息5 min再施以手法，在留针的30 min内反复进行重复捻转手法共3次，舞蹈震颤区则连接电针(华佗牌SDZ-II型)，电针刺激频率10 Hz，电压1V，每次30 min，日1次连续14 d。

美多芭组小鼠给予美多芭悬浊液灌胃，12 mg/mL(含有美多巴1.2 mg)，日1次，连续14 d。

正常组和模型组则不再做任何处理，仅常规饲养。

1.5 处死及取材

在干预的第14 d，完成行为学实验后，处死所有存活小鼠，快速剥离中脑和纹状体，称重，低温保存及进行标本制备。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 行为学观察

各组小鼠于实验建模前5 d每日进行分别进行爬杆及悬挂行为训练各2次。分别于实验前1 d(首次注射MPTP前1天)，造模成功后第0 d，干预第7 d和干预第14 d的10:00时进行爬杆和悬挂行为学观察以检测其肢体运动的协调情况。

1.6.1.1 爬杆实验

将一直径为2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根长60 cm、粗1 cm的木杆顶端，木杆外缠裹2层纱布以防打滑，将小鼠放于球顶，分别记录小鼠爬完杆长的上半部分、下半部分及全杆所需时间，根据评分表进行打分，3个时间分数总和为被测小鼠爬杆实验最终得分。评分标准见表1。

表1 爬杆实验评分标准(分)

1.6.1.2 悬挂实验

将小鼠双前肢悬挂于一水平电线上。根据评分表进行打分。评分标准见表2。

表2 悬挂实验评分标准(分)

1.6.2 Western Blot法检测PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表达

中脑和纹状体组织匀浆，加入裂解液提取总蛋白后，按( BCA 蛋白浓度测定试剂盒) 进行蛋白定量，向每个样品管中加 5 μL的4×Loading buffer混匀，煮沸5 min，蛋白于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，加入PI3K、p-Akt (Ser473)(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃过夜，PVDF膜在室温下结合兔二抗(1∶3 000)2 h，加入ECL显色，采用Image J软件进行灰度值的分析。

1.7 数据统计学处理

2 结果

2.1 行为学实验结果

2.1.1 爬杆实验得分比较

与空白组实验前1 d及同时间点比较，模型组、针刺组及美多芭组小鼠爬杆实验评分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠动作协调性受到破坏，PD模型建立成功；与模型组比较，针刺组及美多芭组小鼠在接受干预后爬杆实验得分均呈增长趋势(P<0.05)；而针刺组与美多芭组进行比较则无差异(P>0.05)。具体比较结果见表3。

表3 各组爬杆实验得分比较分)

注：与空白组实验前1 d比较，*P<0.05；与空白组同时间点比较,△P<0.05;与模型组比较，#P<0.05

2.1.2 悬挂实验得分比较

与空白组实验前1 d及同时间点比较，模型组、针刺组及美多芭组小鼠悬挂实验评分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠动作协调性受到破坏，PD模型建立成功；与模型组比较，针刺组及美多芭组小鼠在接受干预后悬挂实验得分均呈增长趋势(P<0.05)；而针刺组与美多芭组进行比较则无差异(P>0.05)。结果见表4。

表4 各组悬挂实验得分比较分)

注：与空白组实验前1 d比较，*P<0.05；与空白组同时间点比较,△P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

以上行为学实验结果表明，针刺及美多芭均有辅助PD小鼠动作协调性恢复的作用，效果大致相当。

2.2 PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表达

分析图1 PI3K蛋白条带可知，PD建模成功后PI3K蛋白表达均快速上升，经针刺及美多芭干预后PI3K蛋白表达均有不同程度的下降。分析图2 p-Akt(Ser473)蛋白条带可知，PD建模成功后p-Akt(Ser473)蛋白表达均快速下降，经针刺及美多芭干预后p-Akt(Ser473)蛋白表达均有不同程度的上升。

图1 各组PI3K蛋白条带

图2 各组p-Akt(Ser473)蛋白条带

3 讨论

PD患者临床主要表现为静止性震颤、行动迟缓及肌强直等运动障碍症状。现代医学认为，选择性的脑黑质多巴胺能神经元丧失、纹状体多巴胺含量显著减少及黑质和蓝斑存在Lewy小体为PD主要病理特征[7]。

PD属中医“颤证”范畴，其病位脑，基本病机为肝肾阴虚，髓海不足，虚风内动。临床上头针在PD治疗方面有着较好疗效。针刺位于脑部巅顶正中的百会穴，可以起到调神健脑、疏通局部经络气血的作用[8],有通络醒脑、调神治病之功效[9]；有研究表明[10]，针刺舞蹈震颤区可改善PD小鼠运动障碍症状，并可明显减少中脑多巴胺神经元的丢失；风池熄风止颤[11]。诸穴合用，激发头部经气，平衡阴阳，调整全身经络气血，进而改善全身症状。现代研究亦表明[12]，头针可以提高黑质多巴胺能神经元含量、减少黑质细胞的凋亡，改善PD引起的运动症状,进而延缓病情进展,提升患者的生活质量。

目前国内外较为公认的PD建模方法为MPTP诱导法。MPTP作用于C57BL/6品系小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元，进而产生毒性作用，因此产生类似于人类PD的典型临床症状，总体表现为运动协调能力的下降[13-16]。在研究选用观察了PD小鼠不同时期爬杆实验与悬挂实验的评分结果，以此来从行为学的角度评估不同的干预方法对PD小鼠运动迟缓程度及运动平衡能力的影响情况[17]。实验结果显示，头针针刺与美多芭灌胃均可在一定程度上改善PD小鼠运动迟缓的症状、提升其运动平衡的能力，且两组效果大致相当。

PI3K-AKT是调节细胞存活的重要信号转导通路，是目前已知的作用最强、争议最少的抗凋亡途径之一。该通路抑制凋亡的关键作用主要体现在通路激活及下游信号的级联反应上[18-20]。Akt被认为是促进细胞存活的因子，为PI3K的主要靶蛋白之一[21]。Kroner[22]等研究发现，Akt活性的最终实现需要Ser473位点的磷酸化，故而很多研究把测定p-Akt(Ser473)水平作为Akt活化的主要标志。本研究中，PD建模成功后PI3K蛋白表达快速上升，p-Akt(Ser473)蛋白表达快速下降；经针刺及美多芭干预后PI3K蛋白表达均有不同程度的下降、p-Akt(Ser473)蛋白表达均有不同程度的上升。表明头针针刺可以通过激活PI3K-AKT信号通路、调节PI3K及p-Akt(Ser473)蛋白水平来抗细胞凋亡，即PI3K表达水平越低、p-Akt (Ser473) 表达水平越高，则凋亡细胞数越少。

表面看来，在抗细胞凋亡、改善PD小鼠的运动迟缓的症状、提升其运动平衡的能力方面，头针针刺效果与西药美多芭大致相当。但长期服用美多芭不仅费用高昂，更会产生肝肾脏损伤、精神障碍等副作用，比较而言，头针针刺更为安全可靠，操作可重复强，值得临床推广。