四君子汤对16月龄小鼠血浆内源性代谢物质的影响

梁华，闻宏妍，朱明雪，李奇玮，西旺，闫起，王燕，李泽光

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.大连大学，辽宁 大连 116622；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

《宋·太平惠民和剂局方》卷三方之四君子汤，又名白术汤，是主治荣卫气虚的经典基础方剂，“补中有泻，平和中正，不偏不倚”。汪昂《医方集解》曰：“以其皆中和之品，故曰君子也。”方中四味药物皆平和之品，不偏不盛，不热不燥，补而不峻，益而无害，取“君子致中和”之义，故名“四君子汤”[1]。清代医家张璐《伤寒绪论》指出:“气虚者,补之以甘,参、术、苓、草,甘温益胃,有健运之功,具冲和之德,故为君子。”本方命名之本义故显于此[2-3]。后世众多补脾益气方剂多从此方衍化而来[4]。

代谢组学技术有着整体化、微观化等特点,将代谢组学技术与中医药复杂理论体系研究的基本思想、特点优势结合[5]。利用组学技术为挖掘中医药效能提供新的研究途径[6]。继基因组学和蛋白质组学之后代谢组学成为了系统生物学的另一重要的组成部分[7]，作为新发展起来的学科从不同于基因组蛋白组的新角度来观察生物体的状态[8]。本课题组前期已做大量实验研究，探究经典补益剂作用于小鼠增龄过程各阶段与衰老相关的代谢物质发展变化的过程[9-16]。本实验基于代谢组学技术研究四君汤干预下的16月龄小鼠与衰老相关的血浆内源性小分子代谢物质的变化。

1 材料

1.1 动物

选取30只3月龄体质量(40±2)g的SPF级ICR雌性小鼠(辽宁长生生物技术有限公司，许可证批号：SCXK(辽)2010-0001)。饲养于温度(22±2)℃，湿度 (55±15)%的室内，给予固体饲料，自由饮水。

1.2 药物及汤液制备

茯苓、人参、甘草、白术中药饮片采购自黑龙江中医药大学，根据《中华人民共和国药典》拟定制备方法，四君子汤以质量比3∶3∶3∶2将人白茯甘四味中药混合，浸泡后加水(药液∶水=1∶8)，煎煮30 min过滤，提取药液。把所滤得的药渣与水1：8混合后重复以上煎煮过滤过程，将2次煎煮的滤液混合。将设备调至80 ℃，0.09 MPa，进行减压浓缩并回收，获得生药液后配制为0.33 g/mL的质量浓度。

1.3 试剂及仪器

见表1。

2 方法

2.1 实验分组及给药

本实验将30只雌性小鼠随机分为每组10只的3月龄对照组、16月龄空白组及16月龄给药组。将3月龄对照组小鼠每日早晨8：00-8：30用0.9%浓度的NaCl溶液灌胃，重复相同操作持续30 d，取材后冷藏于-80℃冰箱。其余两组小鼠，正常饲养到16个月，到16月龄后，16月龄空白组每日早晨8：00—8：30用0.9%浓度的NaCl溶液灌胃。16月龄给药组用0.33 g/mL药液灌胃。按照小鼠每6天的体质量变化，调整小鼠给水给药剂量。

表1 实验试剂、设备及生产公司

2.2 样品的采集、制备

小鼠饲养方法：1～30 d，给药给水；30 d后，只提供饮水；第31天，采血管中加入肝素钠，取眼球血静置于其中6 h，4 ℃下保持3 500 r/min离心5 min，分离出血浆，置于-80 ℃冰箱。取出冷藏后的小鼠血浆，容量比例为每200 μL血浆加入1 mL甲醇，4℃下保持12 000 r/min离心3 min后，静置15 min抽取上层清液，再一次4 ℃下保持12 000 r/min离心3 min，抽取200 μL上清液进行UPLC-MS分析。

2.3 色谱、质谱条件

色谱柱Acquity UPICTM BEH C18(1.7μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司，美国)；柱温40 ℃；样品仓温保持4℃。见表2，3。

表2 UPLC流动相梯度洗脱程序

注：A：0.1%甲酸-乙腈溶液，B：0.1%甲酸-超纯水溶液

表3 电喷雾离子源正负离子模式程序

2.4 多元数据分析

结合Markerlynx V4.1 softwware、ProgenesisQI 2.1 softwware和 EZnifo softwware模块对3月龄对照组、16月龄空白组及16月龄给药组小鼠血液代谢轮廓数据采用主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析法，以VIP(variable importance in the project)值作为参照筛选标准，筛选VIP值>1的物质。

2.5 标志物的确定

运用QI2.1软件处理, 利用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱，通过在线数据库HMDB、KEGG、Metabo Analyst等检索差异性代谢物及其所参与的代谢通路，探讨标志物及代谢通路的增龄性变化。

3 结果

3.1 小鼠血浆代谢轮廓分析

取3月龄对照组、16月龄空白组及16月龄给药组血浆样本，按照血浆样品制备方法处理，利用己建立的UPLC- HDMS分析模式进行对上述血浆样品正、负离子模式全扫描，结果发现血浆代谢轮廓出现明显差异。小鼠血浆代谢物的PCA分析下， X矩阵解释率R2X>0.4。本实验样品在正离子模式负离子模式下R2X、R2Y值均符合条件，见图1。

3.2 小鼠血液标记物的鉴定

将3月龄对照组、16月龄空白组血液样本进行正负离子模式全扫描，并对3月龄对照组、16月龄空白组小鼠血液代谢数据进行OPIS-DA分析(R2Y>0.5、Q2>0.5)，得到Score Plot 2D、Score Plot3D、VIP-Plot、S-Plot图(见图2，3，4)，从而找到对代谢轮廓变化起关键性作用的内源性代谢物。将潜在生物标记物筛查条件设为P<0.05，VIP贡献值大于1，分析确定内源性生物标记物。利用UPLC-HDMS检测标记物，在human metabolome database及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes等数据库进行检索后，结合Progenesis Q1 2.1 software进行化合物鉴定。筛选出可能与衰老相关的37个潜在标记物(见表4)。

注:A.正离子模式；B.负离子模式图1 3月龄对照组、16月龄空白组及16月龄给药组小鼠血液样品PCA模式识别分析Score plot图

注:A1.正离子模式-2D图；A2.正离子模式-3D图；B1.负离子模式-2D图；B2.负离子模式-3D图图2 3月龄对照组、16月龄空白组雌性小鼠血液样品PCA分析后的Scores plot图

表4 正负离子条件下16月雌鼠血液样品生物标志物(VIP>1)

注：*表示该物质VIP值大于2

注：A.正离子模式;B.负离子模式图3 16月龄空白组、16月龄给药组小鼠血液样品OPLS-DA模式识别分析后VIP散点图

注:A.正离子模式;B.负离子模式图4 16月龄空白组、16月龄给药组小鼠血液样品OPLS-DA模式识别分析后S-Plot图

4 讨论

16月龄相较于3月龄雌性小鼠血浆代谢标志物有明显的增龄性变化。在正负离子模式下通过分析3月龄与16月龄空白组小鼠代谢标志物在其体内变化情况，确定了代谢标志物中12个代谢标志物含量在小鼠3月龄时达到峰值，但随着小鼠的生长发育逐渐消耗降低，它们分别参与了氨酰基-tRNA的生物合成，生物素代谢，赖氨酸降解，色氨酸代谢等13条代谢途径；25个代谢标志物在小鼠体内的含量随生长发育积累增加，参与了酪氨酸代谢、嘧啶代谢、甘油磷脂代谢等8条代谢途径；当取VIP值大于1时，鉴定得到的37个与衰老相关的潜在的生物标记物内，四君子汤干预下对16个代谢标志物起到了调节作用，其中14个具有显著性意义：Palmitaldehyde，Stearaldehyde，Glycerophosphocholine，12-Hydroxy-12-octadecanoylcarnitine，Behenic acid，4-Fumarylacetoacetic acid，L-Tryptophan，Taurodeoxycholic acid，Lactosylceramide (d18:1/12:0)，Taurochenodeoxycholate-3-sulfate，(23S)-23,25-dihdroxy-24-oxovitamine D3 23-(beta-glucuronide)，13S-hydroxyoctadecadienoic acid，(3a,5b)-24-oxo-24-[(2-sulfoethyl)amino]cholan-3-yl-b-D-Glucopyranosiduronic acid，L-Dihydroorotic acid，5-Methoxytryptophol。他们参与了色氨酸代谢，酪氨酸代谢，嘧啶代谢，不饱和脂肪酸的生物合成，甘油磷脂代谢，鞘脂代谢，亚油酸代谢等多项代谢通路。VIP值筛选大于2时，鉴定得到的15个与衰老相关的潜在的生物标记物，对3个代谢标志物起到了调节作用(3个都具有显著性意义)：5-Methoxytryptophol、4-Fumarylacetoacetic acid、Behenic acid。主要参与了酪氨酸代谢。

以上结果分析发现VIP大于2时，四君子汤干预下回调的主要功能代谢物是4-富马酰乙酰乙酸(4-Fumarylacetoacetic acid)，该物质所参与的是酪氨酸代谢。酪氨酸是一种非必需氨基酸，与情绪，新陈代谢，治疗慢性疲劳等疾病有着密切的联系。酪氨酸分解产生4-羟基苯基丙酮酸，4-羟苯基丙酮酸与称为I型酪氨酸血症的代谢性疾病有关。4-羟基苯基丙酮酸是一种潜在的有毒化合物，关于人类的4-羟基苯基丙酮酸被发现与多种疾病有关。4-羟基苯基丙酮酸转化成高纯酸(柠檬酸)，其是计时色素的前体之一。高纯酸可以氧化二聚形成河马豆酸。如果含量足够高，高纯酸可用作骨毒素和肾毒素。骨毒素是导致骨骼或关节受损的物质，肾脏毒素会损害肾脏。积累的高纯酸会损坏软骨(变时性，导致骨关节炎)和心脏瓣膜，还会沉淀成肾结石和其他器官的结石。更具体而言，高纯酸可以转化为苯醌乙酸(BQA)，并且所得的BQA可以轻松转化为类似于深色皮肤色素黑色素的聚合物。这些聚合物沉积在胶原(一种结缔组织蛋白，特别是诸如软骨的组织)中。这个过程被称为年老症。卵巢组织变硬，异常脆弱，损害其正常功能并造成损害。4-富马酰乙酰乙酸是酪氨酸代谢的中间产物之一。富马酸乙酰乙酸酯水解酶(FAH)是一种催化4-富马酸乙酰乙酸酯水解为富马酸酯和乙酰乙酸酯的酶。FAH是酪氨酸分解代谢途径中的最后一种酶。FAH缺乏与1型遗传性酪氨酸血症有关。在酪氨酸分解代谢至4-富马酰乙酰乙酸的途径中产生的4-羟基苯基丙酮酸、高纯酸积累后均会对人体产生毒性积累而致病。本实验观察到四君子汤干预调节的小鼠体内4-富马酰乙酰乙酸含量较16月龄空白组降低，表明四君子汤产生了有利于机体健康的调节作用，减少了酪氨酸代谢过程中产生的毒素积累。

代谢标志物L-色氨酸(HMDB00929)是一种必需氨基酸，它参与了色氨酸代谢。色氨酸代谢后形成5-羟色胺(5-HT)和犬尿氨酸[17]。犬尿酸、黄尿酸、吲哚乙酸和5-羟吲哚乙酸自尿中排出。血清素(5-HT)是重要的神经递质和旁分泌信号分子，已知具有多种生物学功能。游离L-色氨酸经氧化脱羧后转变为5-羟色胺, 主要存在于脑组织、特别是在胃肠道内[18]，它主要负责维持营养吸收和运动[19]。衰老是许多使人衰弱的疾病(包括癌症和神经退行性疾病)的重要危险因素[20]。最近在多种生物中的研究表明色氨酸代谢是与年龄有关的疾病和寿命的有力调节剂。它在整个进化过程中的高度保守性使研究可以开始剖析单个酶和代谢产物的作用[21]。本实验中，与16月龄对照组相比，16月龄给药组的L-色氨酸含量明显回调，表明四君子汤对小鼠的抗衰具有一定的积极作用。

Behenic acid(HMDB00944)参与了不饱和脂肪酸的生物合成。不饱和脂肪酸对人体的缺乏症和内源性疾病有积极的防治作用[22-23]，促进生长发育，调节刺激生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、性腺激素的释放[24]。

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid)有利于防止大鼠动脉粥样硬化的发展，通过调节组织中脂肪酸的代谢来维持组织中脂肪酸的平衡；当CLA少量摄入时，生物体Sod的分子活性增加从而保护机体[25]。

综上所述，小鼠在自然增龄过程中，体内的酪氨酸代谢、色氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等这些代谢通路发生了紊乱，在四君子汤的干预下发生转归，揭示了四君子汤对16月龄小鼠血浆内源性代谢物质的显著影响。然而，四君子汤中四药合参相互协同，基于代谢组学的研究下，我们可以对机体的调节有整体把握，但很难判断出起决定作用的位点。是否可以找出一个或少数几个更小范围的作用位点，抑或是这种起决定性作用的位点是否存在？此外，我们猜想经过四君子汤干预后的VIP值越大的血浆代谢物是否意味着更有价值？这些问题还需要我们进一步的实验和探索。