一种核酸筛查系统在无偿献血检测中的应用价值

李俊英，王艺芳，葛文超，王顼，杨贺才，方建华

(河南省红十字血液中心 检验科，河南 郑州 450053)

血液核酸检测(nucleic acid testing，NAT)是一种高度灵敏的血液传染病检测技术，能显著缩短病毒感染检测“窗口期”，检出病毒变异以及免疫静默的感染，降低输血传播病毒的风险，是临床用血安全的重要保障。随着2015年底核酸检测的全覆盖，低浓度载量问题受到血液筛查实验室的广泛关注[1]，检测系统的性能直接影响检测结果的可靠性。本实验室自2018年10月开始正式启用浩源核酸筛查系统，为评估该系统在本实验室的应用效果，对运行以来7个月的检测情况进行回顾性分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源选取2018年10月至2019年5月采集的57 434例郑州地区无偿献血者血液标本，10例2019年卫健委临床检验中心(National Center for Clinical Laboratories，NCCL)核酸室间质评标本，15例中国国际输血感染预防和控制(China International Transfusion Infection Control，CITIC)核酸室间质评标本。每位献血者留取2管标本：1支酶免管(5 mL，EDTA抗凝)用于酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和血型检测，一支核酸管(5 mL，EDTA抗凝，带分离胶)用于NAT检测。所有标本的采集、运输、和处理均严格按照《血站技术操作规程(2015版)》执行。

1.2 主要试剂ELISA检测试剂：HBsAg检测试剂盒(珠海丽珠，批号2018061008、2018061208、2018112008等；北京万泰，批号B20180622、B20180624、B20190103等)，抗-HCV 检测试剂盒(珠海丽珠，批号20180914081、20181218081；北京万泰，批号C20180821、C20180926、CS20181111等)，HIV Ag/Ab检测试剂盒(法国伯乐，批号8F0438、8K0477、8M0453；北京万泰，批号I20180716、I20181025、H20190101)。NAT试剂：HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA核酸检测试剂盒(PCR荧光法)(上海浩源生物科技有限公司，批号MF20180101、MF20181105、MF20190101)。所有试剂均为中国药品生物检定所批检合格产品，核酸检测配套耗材由试剂公司提供，均在有效期内使用。

1.3 主要仪器使用Hamilton Star全自动加样仪(瑞士HAMILTON公司)和FAME 酶免分析仪(瑞士HAMILTON公司)进行ELISA检测。使用ChiTas BSS 1200全自动核酸纯化仪(上海浩源生物科技有限公司)、ABI 7500实时荧光定量PCR系统(美国ABI公司)和低温大容量离心机KUBOTA 8730(日本KUBOTA公司)进行核酸检测。所用仪器均经过校验，并在有效期内。

1.4 检测模式献血者标本送至检验科后，当日采用2个不同厂家的ELISA试剂进行平行检测，次日从核酸标本管中挑除酶免双侧阳性的标本，剩余标本进行8混样核酸检测。每批实验均设有1孔阳性对照、1孔阴性对照和1孔室内质控。室间质评样品按规定要求进行处理，和普通样本一起上机检测。

1.5 判定规则严格按照试剂盒说明书与标准操作规程(SOP)进行操作，通过软件自动判读结果，需人工复核。内标Ct值>40或未检测到判为无效，混检结果无反应性的pools判为NAT阴性，直接发布结果，有反应性pools进行拆分检测，以拆分结果为最终结果。

2 结果

2.1 核酸检测有效拆分率和阳性率情况浩源核酸筛查系统共检测57 434例核酸标本，混检阳性pools数 69个，共拆出反应标本37例，其中35个HBV DNA阳性标本，2个HIV RNA阳性标本(均由HBV DNA混pools拆出)，有效拆分率随Ct值的升高而降低。见表1。

2.2 室间质评数据2019年上半年浩源核酸筛查系统参加室间质评共2次，10例NCCL标本检测结果与参过结果一致；15例CITIC标本中3例阴性标本，HIV-1 RNA 和HCV RNA阳性样本均能一次全部正确检出；4例HBV DNA阳性标本首次检测有3例未检出，再次充分混匀后均检测出来，HBV、HCV、HIV阳性标本每一种病毒均为4例相同浓度的样品。见表2。

表1 浩源核酸筛查系统各月份NAT结果统计(n，%)

表2 15例CITIC室间质评标本检测结果

注：a试剂说明书标示的检出限；b第二次检测数据，第一次未检出；—表示不适用。

2.3 检测结果无效pools及设备故障共有59个结果无效pools和6次设备故障。室内质控HCV RNA未检出造成的无效结果占比最大，内标无效占比最少。见表3。6次设备故障中第1次为人为操作失误所致，其他5次为设备运行中突发故障，并以D区液面感应异常占比最大。见表3、4。

表3 NAT结果无效混样pools的类型统计(%)

注：内标无效(包括IC-DNA和IC-RNA)指Ct>40。

表4 6次设备故障统计

3 讨论

《血站技术操作规程(2015版)》规定新的或经过维修后可能影响检测结果的检测设备在正式投入正常使用之前应经过确认。本核酸实验室在2018年引入浩源核酸筛查系统，在安装确认之后进行了检测通量、压力测试和试剂分析灵敏度等一系列性能验证，达到了预期要求。通过对该系统日常检测结果的回顾性分析，对其检测性能进行进一步了解。

2018年10月至2019年5月浩源核酸筛查系统核酸总阳性检出率为0.06%，稍低于本中心罗氏系统，高于科华系统[2]及河北地区报道的浩源系统[3]。浩源核酸筛查系统有效拆分率为49.28%，低于罗氏系统，高于科华系统[2]，与其他地区报道的达安有效拆分率(51.72%)相近[4]。本研究结果显示2018年10月核酸阳性率最高，2018年12月和2019年2月核酸阳性率最低，可能是10月份刚投入使用，工作人员对操作不够熟悉，存在一定的假阳性。12月和 2019年2月该系统检测量较少，数据可能有偏差，或由于检测过程的某个环节操作不当引入的污染所致或是检测的非特异性反应结果。2019年3月随着浩源核酸筛查系统逐步开展，实验室人员的熟练操作程度也逐渐提升，设备运行性能、检测结果均较稳定，其有效拆分率逐渐提高，对应的阳性检出率也较稳定。69个混检阳性pools的Ct值大多数处于36～38，且随着混pools Ct值的升高，相应的拆分率降低，这和研究报道中随着混检Ct值的增大，拆分阳性符合率逐渐下降是一致的[5]。检测出的2个HIV RNA阳性标本，均是由HBV DNA混检阳性pools拆分出来，Ct值>39，对两者半年后重新抽样检测，结果NAT和ELISA均为阴性，由此可断定此HIV RNA为假阳性。混检为阳性反应，而拆分无反应性的标本，大都是污染所致的假阳性或非特异性结果，因此日常操作时要严格按照标准操作规程，多注意细节操作，同时也期待检测试剂的特异性进一步提高，以便更好地保证检测结果的准确性。

浩源核酸筛查系统共检测混样pools 7 242个，总pools无效率为0.81%(59/7 242)，低于本实验室罗氏系统[6]和华益美系统[7]。其中室内质控HCV RNA未检出所致的无效pools占比最大，可能为仪器加样量不足或是HCV RNA发生降解所致，这就要求工作人员要正确使用和处理室内质控品，防止样品受到核酶污染。仪器未加上结合液导致无效pools占比次之，是由于加样模块第8通道有异物阻塞，系统软件漏洞未报警而未能及时采取人工干预所致，因此工作人员在实验运行期间定要严密观察，防止漏加、少加液体，并建议系统后期进行软件升级，增加加样的感应功能，以防类似现象再次发生。2个内参无效pools均是Ct值>40，推测为样本含有抑制物或仪器误差导致内标加样量不足。3个pools HIV RNA扩增曲线异常，可能为扩增反应孔的本底信号干扰或反应液混匀、离心时间不足，因此配制扩增反应液后要充分震荡混匀，如模板中有磁珠残留，更要充分离心。

运行期间设备故障共计6次，其中1次属人为操作失误，针对此现象已对工作人员重新进行了仪器操作培训，要求工作人员实验中要严谨细心，规范操作，尽量减少人为误差。5次故障发生在系统运行的前2个月内，可能为开始运行阶段，工作人员对操作不够熟悉，设备性能不够稳定，随着检测的开展，设备性能逐渐平稳，故障次数也逐步减少。另外，需要工作人员留心设备在加样过程中偶有液面探测异常而空加液体的现象，工作人员在设备运行期间务必细心观察，严防漏加，并做好设备的日常维护、校准工作，以保证检测过程的顺利进行和结果的准确性。

2次室间质评结果，10个NCCL样品的检测结果与参考结果一致，15个CITIC样品中，HCV RNA和HIV RNA检测结果的CV分别为2.04%、0.92%，说明本次RNA检测的结果稳定、重复性较好。3例首次混检为HBV DNA阴性的样品，次日将样本充分颠倒混匀再次混检，结果3例样本均能检出HBV DNA，4份结果的CV为9.63%。分析原因为：浩源核酸筛查系统做室间质评样本前，该系统停用了两周，再次启用可能设备性能及状态不稳，以及第1次样本颠倒混匀后，未及时检测，中间放置1 h左右；可能工作人员放置磁珠条时未将其分混匀，影响了对靶基因的捕获效率；样品浓度低于系统检出限，结果会出现一定概率的非反应性，而对样本充分颠倒混匀可使病毒分布均匀，有助于提高检出率；系统对低浓度HBV的检出效果有待进一步评估。

综上所述，通过对浩源核酸筛查系统运行以来的回顾性分析，显示其能够从ELISA阴性标本中筛查出核酸阳性标本，进一步保障了血液安全，同时该系统在运行中也存在一些问题和需改进的地方。由于目前该设备运行时间不长，检测量不够大，各项数据可能会存在一定的偏差，日后将通过进一步的数据积累，更客观、全面地评估其核酸检测效果，也期待核酸检测系统可以进一步完善，提高检测性能。