基于孢子壁蛋白基因靶点的虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR 体系的构建及应用

汪 浩，汪 玮，施 慧，何 杰，谢建军，王庚申，许文军

(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021)

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)最早于2009 年由泰国学者TOURTIPA,et al[1]在生长缓慢的斑节对虾Penaeus monodon 中发现并命名，随后，在泰国本土养殖的患有“白便综合症”(white feces syndrome)的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 中也检出大量的EHP 携带，然而，进一步研究并未发现EHP与对虾“白便”症之间具有相关性[2]。此后几年内，在整个东南亚地区包括印度、中国、越南、马来西亚、印度尼西亚等地相继有EHP 感染凡纳滨对虾的报道[3-5]。自2013 年起，我国的浙江、天津、山东等地区发现了凡纳滨对虾生长迟缓、个体大小不均一的问题，随后在发病对虾中检出并确认其是由于EHP 所引起[5-6]，而后在我国辽宁、粤西地区也相继有EHP 检出的报道，EHP 的检出率和范围呈逐年扩大的趋势[7]。虽然现有的研究并未明确EHP 感染与对虾患病之间的关系，然而，区域数据显示，在出现生长缓慢以及“白便”症状的虾塘中，虾体通常具有较高的EHP 携带率，提示二者间具有一定的关联性[8-9]。

鉴于EHP 感染可能引起对虾生长缓慢等严重危害对虾产业的不良症状，为了更好地监控EHP 的感染和传播，急需一种准确有效的EHP 检测方法。由于EHP 感染没有清晰易察的诊断症状，EHP 虫体通常寄生于对虾肝胰腺或中肠表皮细胞内，成熟的EHP 孢子大小仅为0.7 μm×1.1 μm，光学显微镜难以发现，给诊断带来了难度[1,8]。近年来，国内外学者开发了一批基于SSU rRNA 靶点的分子生物学检测方法，包括常规及套式PCR、地高辛标记核酸探针原位杂交、LAMP、实时荧光定量PCR 等[10-14]。然而，正如TOURTIPA,et al[1]所报道，EHP 的SSU rRNA 与比氏肠胞虫E.bieneusi 具有高达84%的同源性，且养殖对虾中也常有其他种类微孢子虫感染的报道[15]，因而，基于SSU rRNA 设计的各类扩增引物及探针均存在错配和非特异扩增的可能。JAROENLAK,et al[16]分析了TANGPRASITTIPAP A,et al[2]在研究中涉及的EHP 套式检测引物，并将其与4 种可能对EHP 检测产生干扰的微孢子虫的SSU rRNA 序列进行了比对，发现其同源性分别高达86.4%，66.7%，90%和74%，进一步的PCR 检测发现，基于EHP SSU rRNA 设计的套式引物能够有效扩增其中2 种源于蟹的微孢子虫，且扩增产物大小也与阳性对照完全一致，据此，JAROENLAK,et al[16]提出了一种新的基于EHP 孢子壁蛋白(spore wall protein，SWP)基因为靶点的套式PCR 检测方法，相比于SSU rRNA 靶点，SWP 靶点具有更高的特异性。

本研究基于JAROENLAK,et al[16]上传的EHP 孢子壁蛋白基因序列(GenBank：KX258197.1)，设计并构建了基于孢子壁蛋白基因为靶点的EHP 实时荧光定量PCR 检测体系，并利用新构建的检测体系对一例出现生长迟缓、个体大小不一症状的养殖试验塘中的凡纳滨对虾进行了EHP 定量分析，为EHP 的生产检测和流行病学分析提供了新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病样来源

出现生长迟缓、个体大小不一的凡纳滨对虾样本采集自本课题组负责的对虾养殖试验塘，位于浙江海洋大学西闪岛试验基地，所采集的虾样本均测量其体长(精确到0.1 cm)，解剖取出肝胰腺，冻存于液氮中，带回实验室超低温冰箱保存。用于引物特异性检测的凡纳滨对虾病毒及病菌的DNA 模板为本实验室历年采集自舟山本地及象山、临海等地的虾病样中提取并保存。

1.1.2 试剂与仪器

本试验使用的DNA 提取试剂盒购自Qiagen 公司，pEASY-T1 系列载体购自北京全式金公司，高保真Taq 酶、SYBR 荧光定量试剂购自Takara 公司，其他试剂均采用国产分析纯。

试验涉及的主要仪器：NanoDrop 2000c 核酸浓度测定仪(Thermo，美国)、StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo，美国)，Applied biosystems 2720 Thermal Cycler 型PCR 仪(Thermo，美国)，Bio Rad Gel Doc XR170-8170 凝胶成像系统(Bio-rad，美国)。

1.2 虾样肝胰腺总DNA 的提取

将超低温保存的虾肝胰腺取出置于4 ℃冰箱化冻后，剪取部分肝胰腺(10～20 mg)称量后用于总DNA抽提，记录每份肝胰腺样本的重量，整个过程为无菌操作。用于DNA 抽提的肝胰腺组织经剪碎并研磨后，采用DNA 提取试剂盒、按照说明书提供的流程提取总DNA，提取的DNA 经核酸浓度测定仪测量浓度后，冻存于-20 ℃备用。

1.3 引物设计及常规PCR

根据Genbank 收录的虾肝肠胞虫孢子壁蛋白基因(序列号KX258197.1)，利用Primer Premier 5.0 设计1 对特异性引物SWP-RTF(5′-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGT-3′) 和SWP-RTR (5′-GCTGTTTGTCTCCAACTGTAT-3′)，预计扩增目的片段碱基数为184 bp。以携带EHP 的虾肝胰腺DNA 为模板，SWP-RTF/R为引物，采用50 μL 扩增体系：5 μL 10 × PCR 缓冲液，4 μL dNTP (2.5 mmol·L-1)，1 μL 模板DNA,0.5 μL SWP-RTF/R 引物(20 μmol·L-1)，0.5 μL 高保真ExTaq 酶,38.5 μL ddH2O。PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s、55 ℃40 s、72 ℃20 s，40 个循环；72 ℃，8 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 标准品模板的制备

上述常规PCR 获得SWP 的扩增产物后，用核酸浓度测定仪测定其浓度，使用pEASY-T1 Simple Cloning kit 试剂盒按照说明书推荐的反应体系进行TA 克隆，并通过热激转化Trans1-T1 感受态细胞。完成转化的感受态细胞经复苏培养后，涂布于含有卡那霉素的LB 平板上，过夜培养。挑选平板单菌落，用M13F/M13R 引物进行PCR 检测，选取检测结果阳性的1～2 个单克隆，用OMEGA 质粒小量提取试剂盒抽提质粒，送上海华大基因公司测序。测序结果与KX258197.1 序列比对100%吻合的质粒命名为SWP-T，经核酸浓度测定仪测定其浓度为211 ng·μL-1，换算成拷贝数为5.02×1010copies·μL-1，以此质粒作为标准品原液，冻存于-20 ℃备用。

1.5 实时荧光定量PCR 反应体系的建立及优化

实时荧光定量PCR 反应体系参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH plus)试剂盒说明书推荐的20 μL反应体系，并对不同的引物浓度及退火温度的扩增效果进行对比。设置0.2、0.4、0.6 μmol·L-13 种引物终浓度，退火温度设置为55～60 ℃。扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃5 s，55～60 ℃30 s，40 个循环。扩增完成后测定熔解曲线。

1.6 标准曲线的测定

将制备好的标准品原液用ddH2O 进行10 倍梯度稀释，获得终浓度为5.02×101～5.02×108copies·μL-1的8 个浓度梯度，每个梯度设置3 个平行，按照上述优化的体系进行qPCR，得出拷贝数与Ct 值的线性关系，根据扩增效率和相关性系数对标准曲线的质量进行分析。

1.7 qPCR 灵敏度测试

将标准品原液用ddH2O 梯度稀释成5.02×100～5.02×108copies·μL-1共9 个梯度，作为测试模板，以SWP-RTF/R 作为引物，按照上述建立的qPCR 反应体系进行扩增。常规PCR 采用模板浓度为5.02×101～5.02×106copies·μL-1共6 个梯度，按照先前设定的体系进行扩增。扩增完成后，对2 种方法的灵敏度进行对比分析。

1.8 qPCR 引物的特异性检测

选取本实验室前期采集保存的、分别感染了传染性皮下造血器官坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(SHIV)、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 或哈维氏弧菌V.harveyi 的虾总DNA，以携带EHP 的虾总DNA 作为阳性对照，健康虾总DNA 作为阴性对照，去离子水作为空白对照，按照上述优化的qPCR 反应体系，检测引物SWP-RTF/R 的特异性。

1.9 应用qPCR 分析EHP 携带量与虾个体大小间的关系

从出现生长缓慢、个体大小差异明显症状的凡纳滨对虾养殖试验塘中随机采集51 尾虾，按个体大小(体长差异)分为3 组，每组17 尾：a 组体长7～9 cm；b 组体长10～12 cm；c 组体长13～15 cm。按上述构建的qPCR 体系对3 组虾样分别作单尾虾EHP 携带量检测，以每克虾肝胰腺组织中携带的EHP 拷贝数的对数值定义为感染指数(relative exponential copies of EHP infection)，绘制虾的体长与感染指数的XY 散点图，对3 组处于不同大小区间的虾样分别计算其感染指数的平均值、标准差，并分析体长与感染指数的相关性。

2 结果

2.1 qPCR 反应体系的建立及优化

采用5×104copies·μL-1浓度的SWP-T 标准质粒作为模板，确立了基于EHP-SWP 为靶点的qPCR 的最佳反应体系，其中引物浓度为0.2 μmol·L-1时扩增效率最高，退火温度为60 ℃时引物特异性及扩增效率最佳。即最佳反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 试剂10 μL，20 μmol·L-1的SWP-RTF/R 引物各0.4 μL，ROX Reference Dye 校正液0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6.8 μL；扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。

2.2 标准曲线的绘制

利用优化好的条件对10 倍梯度稀释(5.02×101～5.02×108copies·μL-1)的质粒标准模板进行qPCR 扩增，绘制Ct 值与标准模板拷贝数对数值[log(SQ)]之间线性关系的标准曲线。结果显示，质粒标准模板在5.02×101～5.02×108copies·μL-1范围内，qPCR 均有明显荧光信号出现，Ct 值在8～32 之间；构建的标准曲线(图1)换算公式为：Ct=-0.284 4 log(SQ)+10.45，R2=0.992。扩增产物熔解曲线(图2)起峰单一，起峰位置高度重叠，熔解温度(Tm 值)为79.76 ℃，表明该方法扩增过程中没有非特异扩增和引物二聚体的产生。

图1 虾肝肠胞虫SWP 标准品qPCR 扩增的标准曲线Fig.1 The standard curve of qPCR for SWP of EHP with standard plasmid as the template

图2 虾肝肠孢虫SWP 标准品qPCR 扩增产物的溶解曲线Fig.2 Melting curves of qPCR for SWP of EHP with standard plasmid as the template

2.3 qPCR 与常规PCR 灵敏度对比

qPCR 扩增结果显示(图3)，对于浓度在5.02×101～5.02×108copies·μL-1区间内的标准质粒模板，qPCR均有明显的荧光信号，Ct 值在8～33 之间，当模板浓度稀释至5.02×100copies·μL-1时，qPCR 无明显的荧光信号，说明qPCR 的最低检测限为5.02×101copies·μL-1。与此对应的，浓度为5.02×101～5.02×106copies·μL-1的质粒模板的常规PCR 扩增35 个循环后的电泳结果显示，当质粒浓度降至5.02×102copies·μL-1时，电泳条带微弱至几不可见(图4)，当质粒浓度为5.02×101copies·μL-1时，电泳条带消失。通过2 种方法的比较，说明qPCR 较常规PCR 检测的特异性至少高出1～2 个数量级。

图3 虾肝肠胞虫SWP qPCR 扩增的灵敏度测试Fig.3 Sensitivity test of qPCR for SWP of EHP with plasmid standard template

图4 虾肝肠胞虫SWP 常规PCR 扩增的灵敏度测试Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR for SWP of EHP with plasmid standard template

2.4 qPCR 引物特异性检测

经BLAST 搜索，通过Primer Premier 5.0 设计的基于虾肝肠胞虫SWP 基因的引物SWP-RTF/R 在NCBI 数据库中未发现与其他病原序列相匹配。针对分别感染不同虾病原(EHP、IHHNV、WSSV、SHIV、副溶血弧菌、哈维氏弧菌)的虾总DNA 模板的qPCR 扩增结果显示，除携带EHP的虾DNA 模板呈现出特异扩增曲线外，其它模板均无荧光信号(图5)，说明本方法设计的引物SWP-RTF/R 具有良好的特异性。

图5 虾肝肠胞虫SWP qPCR 扩增曲线Fig.5 The amplification curve of specific detection for SWP of EHP

2.5 qPCR 重复性检测

对梯度稀释的质粒标准模板(5.02×102～5.02×108copies·μL-1)进行qPCR 扩增，每个浓度梯度设置3 个平行重复，对取得的Ct 值计算平均值、标准差和组内的变异系数。检测结果显示，组内3 个平行的Ct 值基本一致，变异系数均小于2%(表1)，满足qPCR 对于组内重复性的要求。表明此方法有良好的重复性，检测结果稳定可靠。

表1 虾肝肠胞虫SWP qPCR 组内重复性检测Tab.1 Intra-group variability qPCR test for SWP of EHP

2.6 应用qPCR 分析EHP 携带量与虾个体大小间的关系

对采集自浙江海洋大学西闪岛试验基地虾塘内的3 组体长具有明显差异的对虾，qPCR 检测结果显示，51 尾虾样均有EHP 携带(图6)。其中，体长区间位于7～9 cm 的17 尾虾，平均感染指数为5.69±0.91，平均体长8.13±0.52 cm，感染指数与体长间具有极显著的负相关(R=-0.650，P＜0.01)；体长区间位于10～12 cm 的17 尾虾，平均感染指数为4.86±0.39，平均体长为11.06±0.65 cm，感染指数与体长也具有较显著的负相关(R=-0.532，P＜0.05)；体长区间位于13～15 cm 的17 尾虾，平均感染指数为4.51±0.55，平均体长为13.53±0.44 cm，感染指数与体长的相关性不显著，呈较弱的负相关(R=-0.147)。对3 组虾样数据的统一分析表明，51 尾虾的感染指数与体长之间也呈现出一定的相关性(R2=0.452)。

图6 采集自西闪岛试验基地虾塘的凡纳滨对虾肝胰腺中EHP 感染指数与体长的相关性Fig.6 The correlation between the relative exponential copies of EHP infection in hepatopancreas and body length

3 讨论

虾肝肠胞虫自2009 年被泰国学者发现以来[1]，影响范围不断扩大，整个东南亚地区主要的对虾养殖国均陆续有EHP 感染的报道[3-5]。虽然目前尚未发现EHP 感染会引起对虾死亡，然而，高浓度的EHP 携带可导致对虾生长迟缓的观点已普遍为学者所认可[4-5]。EHP 可通过水体及食物等方式传播感染[17-19]，在感染早期没有明显的症状，也不像其他寄生水生动物的微孢子虫一样可观察到孢囊[5]。EHP 孢子寄生于细胞内且个体极小，光学显微镜难以观察到，因而，开发一种准确、高效的分子生物学检测方法十分必要。

荧光定量PCR 相较于常规PCR 法有着操作简便、快速高效、高敏感性、高重复性和高特异性、既可定性又可定量等诸多优势[20]。有关虾肝肠胞虫的荧光定量检测方法，国内已有学者报道[13-14]，然而，现有的检测体系都是基于EHP 的SSU rDNA 序列设计的引物。有研究表明[16]，EHP 的SSU rDNA 序列与多种感染水生动物的微孢子虫具有很高的同源性(66.7%～90%)，因而，基于SSU rDNA 靶点设计的检测引物存在错误匹配和非特异性扩增(假阳性)的可能。本研究构建的qPCR 检测体系是基于EHP 的孢子壁蛋白(spore wall protein，SWP)序列靶点，相较于SSU rDNA 序列靶点具有更高的特异性。应用本研究构建的检测体系对采集自试验塘的一批出现生长迟缓症状的虾样品进行EHP 携带量检测，结果发现，在一定的体长区间(7～12 cm)范围内，EHP 感染指数(每克肝胰腺组织中携带EHP 拷贝数的对数值)与体长之间呈现出显著的负相关性，这种相关性在体长7～9 cm 区间内比体长10～12 cm 区间内更为显著(前者P＜0.01；后者P＜0.05)；而当体长上升到13～15 cm 区间时，这种相关性变得不显著。刘珍等[14]的研究也表明，虾的体长与EHP 载量之间的相关性会随着体长区间的变化而变化，但在不同批次的样品中，这种变化似乎没有一定的规律(如：某一批次的样品在体长＞4.2 cm 时表现出显著相关性；另一批次样品则在体长＜4.4 cm 时具有更显著的相关性)。鉴于目前对EHP 的感染及致病机制尚不明确，我们推测上述现象其可能与养殖水体环境、苗种差异、饲料营养差异等诸多因素有关。对于51 尾虾的全部数据的汇总分析显示，EHP 感染指数与体长具有一定的相关性(R2=0.452)，大体趋势是体长越小的虾，其EHP 携带量相对越多。我们推测这可能与EHP 感染的时间早晚有关：感染时期早的虾，其生长在早期即受到抑制，同时，由于EHP 在虾体内停留的时间长，增值的拷贝数也相对较多；反之亦然。总体来说，本研究为EHP 的定量检测提供了一种新的方法，应用本方法检测EHP 具有特异性强、灵敏度高、操作方便快捷等优势，为EHP 的早期监测和防控提供了新的手段和思路。