鳕鱼皮免疫活性肽的制备

周 勰，陈楚央，唐云平，陈 艳，杨最素

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022）

免疫系统是机体非常重要的生理防御系统，其稳定性与机体是否能够保持健康有很大的关系。免疫系统不平衡会影响机体的免疫应答，从而导致各种疾病的发生[1]。巨噬细胞是生物体中非常重要的免疫细胞，在机体的生命周期中十分重要，具有抗感染、影响组织炎症的发展等作用[2-3]。目前，临床上已使用许多药物来调节机体的免疫功能，但是大多数合成的免疫调节药物都具有副作用，还可能影响免疫系统，从而增加感染的风险[4-5]。因此，寻找天然来源的免疫调节剂已引起人们的广泛关注。

鳕鱼Gadus macrocephalus 属于鳕形目、鳕科、鳕属，属于深海鱼类，在我国的黄海和东海北部等地区产量较为丰富。鳕鱼其肉质鲜美，富有营养，有着可观的营养价值和经济价值，我国每年的鳕鱼加工量可达50×104t，在其加工过程中有大量的下脚料产生[6]。下脚料的丢弃不仅仅是资源的浪费，还造成了一定的环境压力。鳕鱼皮作为鳕鱼加工的副产物之一，含有丰富的胶原蛋白，但是其分子量比较大，不能很好地被人体直接吸收利用[7]。故将胶原蛋白水解为分子量更小的肽，就能够更好地被机体吸收。近年来的研究表明鳕鱼皮胶原蛋白肽具有防治骨质疏松、抗氧化、护肝、抗癌等作用[8-9]。从海洋生物中提取促进免疫调节作用的活性肽是近年来的研究热点，然而从鳕鱼皮中提取促进RAW 264.7 细胞增殖的免疫调节肽目前尚未见报导。本研究以鳕鱼皮为实验原料，通过单因素和正交试验优化酶解鳕鱼皮制备免疫活性肽，并通过测定RAW 264.7 细胞的增殖率探究不同分子量酶解产物的免疫调节活性，以期为开发鳕鱼皮的精深加工提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鳕鱼皮购自浙江舟山佳和食品加工有限公司。巨噬细胞RAW 264.7 细胞购自中科院上海细胞所，由本实验室传代培养。碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶购自北京亚太恒信生物科技有限公司。DMEM 培养基购自Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自德国AppliChem 公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Sigma 公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HWS-24 数显恒温水浴锅，山东城创新仪器有限公司。Cogent μScale 超滤系统，美国密理博公司。pHS-250 pH 计，上海理达仪器厂。CF16RN 高速冷冻离心机，日立仪器有限公司。Forma 3111 型CO2培养箱，美国Thermo 公司。倒置显微镜及CCD 拍摄装置，日本OLYMPUS 公司。ALPHA 1-4/LD plus 型冷冻干燥机，德国CHRIST 公司。Spectra Max M2 多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司。

1.3 方法

1.3.1 鳕鱼皮免疫活性肽制备流程

鳕鱼皮→NaOH 去杂蛋白→冰醋酸溶胀→酶解→冷冻干燥→鳕鱼皮免疫活性肽。

1.3.2 鳕鱼皮的预处理

鳕鱼皮剪成1 cm×1 cm 小块，洗净后用0.1 mol·L-1NaOH 浸泡6 h 后，用蒸馏水冲洗至中性。随后用0.1 mol·L-1冰醋酸溶胀12 h，用蒸馏水冲洗至中性后，放-20 ℃环境保存备用。

1.3.3 最优酶种的筛选

称取10 g 经预处理的鳕鱼皮，分别在胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶各自的最适酶解条件下进行酶解[10]。酶解完成后沸水浴灭酶活15 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，冷冻干燥后备用。采用MTT 法检测RAW 264.7 细胞的细胞增殖率[11]，以其作为指标，选出最优酶种。RAW 264.7 细胞的培养参照文献[12]进行并适当改进，并取对数生长期的细胞进行实验。4 种蛋白酶的酶解条件见表1。

表1 4 种蛋白酶的酶解条件Tab.1 Enzymatic hydrolysis conditions for four protease

1.3.4 单因素实验和正交试验

称取10 g 经预处理的鳕鱼皮，使用1.3.3 筛选出的最优酶种，以酶解温度、加酶量、酶解时间和pH 为影响因素进行单因素实验，以游离氨基氮（ANN）含量为指标，来确定酶解的条件范围。ANN 含量用甲醛电位滴定法测定[13]。根据单因素实验结果，选取L9(34)正交试验记录表，仍以鳕鱼皮酶解物的水解度作为评价指标进行正交试验，得到最佳酶解条件。

1.3.5 超滤截留

根据1.3.4 的实验结果，获得的鳕鱼皮酶解液先经过0.45 μm 滤膜抽滤，再用超滤系统进行超滤分段，得到4 组不同分子段的提取液，分别为＜1 kD、1～5 kD、5～10 kD、＞10 kD，并将各分子段的超滤液进行冷冻干燥。将4 组不同分子段的产物制成2 mg·mL-1样品药物浓度，分别作用于RAW 264.7 细胞，筛选出对细胞增殖率影响最大的组分。

1.3.6 鳕鱼皮免疫活性肽制备流程

RAW 264.7 细胞置于含10 %无支原体的胎牛血清和双抗的DMEM 培养基中，于37 ℃、5 % CO2条件下培养。当细胞生长至80%时进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。调整细胞密度为1×104个·mL-1，将细胞分成5 组，空白对照组，多肽低浓度组（50 mg·mL-1），多肽中浓度组（100 mg·mL-1）；多肽高浓度组（150 mg·mL-1）和LPS 阳性组(LPS 浓度1 μg·mL-1)。按每孔200 μL 培养液接种于96 孔板上，板边缘用无菌PBS 填充，37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育12 h 后弃去上清；加入不同浓度的鳕鱼皮多肽各200 μL，每个浓度3～6 个复孔，并设置空白对照组；12～36 h 后吸去上清，每孔加入10 %的MTT（5 mg·mL-1）200 μL，继续在培养箱中孵育4 h；弃上清后加入150 μL 的DMSO，振荡10 min，于490 nm 处测定吸光度(A)，计算细胞相对增殖率。相对增殖率按公式（1）计算：

式中，A1为空白对照组的吸光度，A2为样品组的吸光度。

1.3.7 数据处理

数据均用x¯±s 表示，使用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析和处理，以P＜0.05 表示差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 最优酶种的筛选结果

由图1 可知，碱性蛋白酶酶解物对RAW 264.7 巨噬细胞增殖率高达31.17%，远超过其它蛋白酶酶解产物。因此本实验选择碱性蛋白酶制备鳕鱼皮免疫活性肽。

图1 不同酶种对RAW 264.7 细胞增殖率的影响Fig.1 Effects of different enzymes on the proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2 碱性蛋白酶单因素实验结果

2.2.1 碱性蛋白酶单因素水平

以酶解温度、加酶量、酶解时间和pH 为影响因素进行单因素试验，以ANN 含量为指标，来确定酶解的条件范围见表2。

表2 单因素水平表Tab.2 Factor and levels

2.2.2 酶解温度对鳕鱼皮酶解物的ANN 含量的影响

由图2 可知，随着酶解温度的增加，酶解物的ANN 含量持续上升，当温度超过50 ℃后，ANN 含量下降。由于高温可使酶失活，当温度超过酶的最适温度，酶活性会下降，ANN 含量也相应减少[14]。因此，选择45～50 ℃的酶解温度进行正交试验。

图2 加酶量对酶解物的ANN 含量的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on ANN content of hydrolysates

2.2.3 加酶量对鳕鱼皮酶解物的ANN 含量的影响

由图3 可知，随着加酶量的增加，ANN 含量呈上升的趋势。但当加酶量超过2 500 U·g-1后，ANN 含量基本持平或者少量提高。当加酶量适量或较少时，底物与酶会充分结合，ANN 含量会随着加酶量的增加而增加。但是超过一定量后，底物基本被饱和，此时再增加酶含量，ANN 含量不会再发生大的变化[15]。因此，选择1 500～2 500 U·g-1的加酶量进行正交试验。

图3 加酶量对酶解物的ANN 含量的影响Fig.3 Effect of enzyme volume on ANN content of hydrolysates

2.2.4 pH 对鳕鱼皮酶解物的ANN 含量的影响

由图4 可知，在pH 在6～10 之间，随着pH 的增大，ANN 含量先增加后减少。当pH 为8 时，ANN 含量最高。这可能是因为碱性蛋白酶的pH 过高或过低都会导致酶活性的降低，从而影响底物的水解[16]。综合考虑后，选择pH 7～9 的进行正交试验。

图4 pH 对酶解物的ANN 含量的影响Fig.4 Effect of pH on ANN content of hydrolysates

2.2.5 酶解时间对鳕鱼皮酶解物的ANN 含量的影响

由图5 可知，在1～7 h 之间，随着酶解时间的增加，酶解物的ANN 含量明显升高。但在7～9 h 之间，随着酶解时间的增加，酶解物的ANN 含量基本保持不变。可能是因为底物已被酶解完，随着时间的增加，ANN 含量不会有太大的改变[17]。综合考虑后，选择酶解时间为5～7 h 进行正交试验。

图5 酶解时间对酶解物的ANN 含量的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on ANN content of hydrolysates

2.3 正交试验结果

碱性蛋白酶酶解鳕鱼皮的正交试验是在单因素实验的基础上，从中选择出合适的梯度进行，以得到大批量酶解的最优条件，结果见表3。各因素对碱性蛋白酶酶解产物水解度影响的顺序为酶解时间＞酶解温度＞加酶量＞pH。由正交试验的结果可以得出，最优的酶解条件为：酶解时间7 h、酶活力为2 500 U·g-1、pH 8、酶解温度为50 ℃。

表3 L9(34)正交试验结果Tab.3 Results of L9(34) orthogonal test

2.4 超滤截留结果

将大量酶解得到的酶解液超滤后分为4 组不同的分子段，分别为＞10 kD、5～10 kD、1～5 kD 以及＜1 kD，以2 mg·mL-1作用于RAW 264.7 细胞，利用MTT 法观察其对RAW 264.7 细胞增殖情况的作用。结果见图6，＜1 kD 的酶解物对RAW 264.7 细胞的增殖率影响最大，细胞增值率高达16.40%，与其它各组相比P＜0.05，表示差异具有显著性。

图6 不同分子量对RAW 264.7 细胞增殖率的影响Fig.6 Effects of different molecular weights on the proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.5 倒置显微镜观察RAW 264.7 细胞结果

如图7 所示，空白对照组细胞数较少，细胞形态良好且排列紧密；阳性对照组RAW 264.7 细胞数量明显增多，出现显著的棱角和凸起。多肽的低浓度、中浓度、高浓度3 组细胞随浓度增加，细胞数量明显增多，细胞出现分化和伪足的数量也明显增多。说明从鳕鱼皮中提取的肽在一定浓度内具有免疫调节作用，能促进巨噬细胞的增殖能力。

图7 RAW 264.7 细胞形态（×200）Fig.7 The morphology of RAW 264.7 cells

3 结果与分析

免疫细胞增殖是其在免疫调节中发挥相应作用的前提和基础。据报道，诸多的免疫活性肽具有增强巨噬细胞的吞噬能力和增殖活性的作用，能调节机体的免疫能力，提高机体抵御外界异物侵害的能力[2,18-19]。巨噬细胞系RAW 264.7 细胞容易获得，便于培养，常作为模型用来评价活性物质在分子水平的免疫调节作用[20]。故本实验选用RAW 264.7 巨噬细胞，以检测其细胞增殖率确定酶解条件和免疫活性肽制备的指标。本研究筛选出提取鳕鱼皮免疫活性肽的最优酶种为碱性蛋白酶。碱性蛋白酶制备免疫活性肽的最优条件是：酶解时间为7 h、酶活力为2 500 U·g-1、pH 为8、酶解温度为50 ℃。酶解液通过超滤得到4 组不同分子段，分别为＜1 kD、1～5 kD、5～10 kD、＞10 kD。通过检测其对RAW 264.7 细胞的增殖率的影响，发现＜1 kD分子段酶解液具有最高的细胞增殖率。在倒置显微镜下观察发现＜1 kD 的胶原蛋白肽可以促进RAW 264.7 巨噬细胞的增殖，并随给药浓度的增加，大部分细胞产生伪足，更有利于增强巨噬细胞的吞噬活性。表明鳕鱼皮胶原蛋白肽具有增强RAW 264.7 细胞的免疫活性，同时为今后鳕鱼皮的研究提供了一定的实验依据。