血管紧张素转化酶2在结直肠癌中的表达及意义

董惠 王卫峰 冯玉良 朱琴 丛衍群 张虹 郑培奋

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其病死率较高[1]。近年来由于饮食结构及生活环境的变化，我国结直肠癌发病率也逐年升高[2]。结直肠癌的发生涉及复杂的生物遗传方面的多级联反应[3]，而血管紧张素转化酶2（ACE2）变化可能是结直肠癌发生、发展过程中的机制之一。笔者基于当前Oncomine、人类蛋白质图谱（human protein atls，HPA）、GEPIA可视化的癌症大数据公共在线平台，分析ACE2在结直肠癌组织中的表达以及与结直肠癌预后的关系，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 资料来源 本研究资料来源于Oncomine数据库（http://www.oncomine.org/resource）、HPA数据库（http://www.proteinatlas.org/）、GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）。

1.2 数据提取 （1）Oncomine数据库：可提供肿瘤和正常组织的基因差异表达分析。本研究设定的数据挖掘及筛选条件：①gene：ACE2：colorectal cancer；②cancer type；③data type：mRNA；④analysis type：cancer vs normal analysis；⑤设定临界值（P＜0.01，fold change＞2，gene rank=top10%）。（2）HPA数据库：研究人员使用高度特异性的抗体，用免疫检测技术测定蛋白在细胞系、人类正常组织和肿瘤组织中的表达情况，该数据库绘制了人体正常组织、细胞以及肿瘤组织、细胞中表达基因编码的蛋白位置。本研究以ACE2、结直肠癌为关键筛选条件：①search：ACE2；②type：tissue atlas：colorectal caner。在搜索框中输入ACE2，分别选择“tissue”及“pathology”，组织来源选择“colon”。（3）GEPIA 数据库：可整合分析癌症表达谱数据。在搜索框中输入ACE2，分析工具栏里选择“correlation analysis”，datasets selection为“COAD、READ”，置信区间设置为95%。其他参数均设置为数据库默认。分析ACE2基因与结直肠癌发生关系密切的错配修复基因表达的相关性后，再应用“survival plots”模块进一步分析ACE2基因与结直肠癌生存预后的关系。

1.3 统计学处理 采用数据库自带模块进行统计分析。结直肠癌组织与正常结直肠组织中ACE2基因表达的比较采用两独立样本t检验；ACE2基因表达量与错配修复基因表达量的相关性分析采用Pearson相关；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，结直肠癌患者ACE2基因高、低表达组生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACE2在常见肿瘤组织中的基因表达情况 Oncomine数据库共收集330项关于ACE2在不同类型肿瘤组织与正常组织中基因表达比较的研究结果，其中29项研究结果显示差异有统计学意义（均P＜0.05），包括ACE2基因表达增高的研究5项，降低的研究24项。其中ACE2在结直肠癌中基因表达增高的研究0项，降低的研究2项，见图1（插页）。

2.2 ACE2在结直肠癌组织中的表达情况 Oncomine数据库有7个数据集包括583个样本涉及结直肠癌组织与正常结直肠组织ACE2基因表达的比较，选择低表达数据库，结果其中3个数据集中的3项分析显示结直肠癌组织中ACE2基因表达量低于正常结直肠组织（均P＜0.01），见图2（插页）和图3。若选择高表达数据库，发现3项数据集中ACE2基因表达量在结直肠癌组织中呈高表达，但3者进行差异基因分析，结果显示差异无统计学意义（P＞0.05）。GEPIA数据库中结肠癌及直肠癌的研究包括1 034个样本，分别对结直肠癌组织及正常组织ACE2转录水平情况进行比较，结果显示ACE2在结直肠癌组织中的转录水平明显高于正常结直肠组织（均 P＜0.05），见图4。

2.3 ACE2在正常结肠组织与结肠癌组织中的蛋白表达比较 从HPA数据库中得到ACE2基因表达筛选结果，显示ACE2在结直肠癌组织中的蛋白表达明显高于正常结直肠组织，见图5（插页）。

2.4 ACE2基因表达量与错配修复基因表达量的相关性 利用GEPIA数据库相关性分析模块，对ACE2基因表达量与MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2等6种错配修复基因表达量进行分析，结果显示均有明显相关性（均 P＜0.05），见图 6（插页）。

2.5 结直肠癌患者ACE2基因高、低表达组生存率比较 利用GEPIA数据库生存分析模块进行分析，结果显示结肠癌或直肠癌患者ACE2基因高、低表达组总生存率、无病生存率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图 7（插页）。

图1 Oncomine数据库ACE2在常见肿瘤组织中的基因表达情况

图2 Oncomine数据库ACE2在结直肠癌组织中的基因表达（1～3表示3项研究结果，蓝色越深表示ACE2基因在该芯片中的表达越低）

图3 Oncomine数据库3项研究关于结直肠癌组织与正常结直肠组织ACE2基因表达的比较

图4 GEPIA数据库ACE2在结直肠癌组织与正常结直肠组织中的基因表达（*P＜0.05）

图5 HPA数据库ACE2在正常结肠组织与结肠癌组织中的蛋白表达（免疫组化染色，电子显微镜下观察，×40）

图6 GEPIA数据库ACE2基因表达量与错配修复基因表达量相关性的散点图（a、b、c、d、e、f分别表示ACE2基因表达量与MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2 基因表达量的相关性）

图7 GEPIA数据库ACE2基因高、低表达的结直肠癌患者生存曲线（a、c：结肠癌；b、d：直肠癌）

3 讨论

ACE2发现于2000年，是ACE同系物[4]，大量存在于肠上皮细胞、肺泡Ⅱ型细胞、微血管内皮细胞和肝细胞[5]。动物实验证实，ACE2过表达可以减少内质网应激、氧化应激及炎症反应等，进而减少胰岛细胞[6]、肺内皮细胞[7]、人脐静脉内皮细胞[8]的凋亡，抑制心肌梗死后心肌纤维化[9]。但是，目前关于ACE2在肠道中的作用尚未完全明确。Bernardi等[10]研究发现，结肠肿瘤患者ACE2蛋白活性明显升高，但差异无统计学意义，可能与样本量有限及样本间存在高度变异性相关。房静远教授团队近期对正常人和结直肠肿瘤患者结肠上皮细胞ACE2进行单细胞测序，发现正常结肠上皮细胞、腺瘤、结直肠癌组织中ACE2表达量逐渐增加[11]。

本研究通过Onconimine数据库挖掘ACE2基因在常见肿瘤中的表达情况，结果在差异有统计学意义的29项研究中，24项研究的ACE2基因表达量降低；其中关于结直肠癌的研究中有2项研究提示低表达。进一步分析发现结直肠癌ACE2在不同研究的数据集中，结果显示高、低表达均有报道，这可能与样本量大小有关。通过GEPIA数据库发现，ACE2在结肠癌及直肠癌的转录水平较正常组织高。利用HPA数据库提供的免疫组化信息，在蛋白水平上比较结直肠癌组织与正常组织中ACE2表达，发现结直肠癌组织中ACE2蛋白呈高表达，提示ACE2在结直肠癌的发病过程中可能发挥重要的作用。另外，结直肠癌患者中ACE2在基因及蛋白水平的表达也存在差异：一方面，ACE2在肿瘤的不同分期及病理类型中基因表达量可能不同；另一方面，蛋白的表达不仅受基因丰度水平的影响，还涉及转录后基因产物的修饰等机制[12]。但在Oncomine数据库中，不同数据集中ACE2基因在结直肠癌的表达存在分歧，提示目前仍需要开展大样本的临床研究，以进一步明确ACE2在基因水平的表达情况。

结肠细胞在DNA复制过程中若出现碱基错配，可引起子代DNA链突变，进而造成新生细胞性状的改变，甚至引起癌变[13]。机体内的基因错配修复系统包括MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、PMS1和PMS2。错配修复基因的突变或功能缺失，是结肠癌发生的重要机制之一[14]。通过GEPIA数据库提供的相关性分析模块，发现ACE2与基因错配修复系统中的MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1 和 PMS2 基因的表达具有明显相关性，表明ACE2基因可能参与结直肠癌的发病过程。但是ACE2的表达水平与结直肠癌的生存预后无相关性。鉴于目前的研究结果，仍需要探究结直肠癌在不同分期及淋巴结转移情况下ACE2基因及蛋白的表达变化，以进一步明确ACE2在结直肠癌发病过程中的作用。

综上所述，本研究通过多种大样本的公共在线数据库和系统的生物信息学方法明确了ACE2蛋白在结直肠癌中高表达，同时表明生物信息学分析可提供更多潜在的结直肠癌的重要基因，为结直肠癌的治疗研究提供新的方向。