发酵过程中一键式程序灭菌方法介绍及优势探讨

（国药集团重庆医药设计院有限公司，重庆 400042）

关键字：一键式灭菌；实消；连消；发酵

随着生物发酵工业规模的扩大，生产中种子罐和发酵罐体积和数量也在增加，并且发酵过程要在没有杂菌污染的条件下进行，为了避免染菌、保持生产的正常进行，这就要求企业投入更多的人力，也就会不可避免地增大灭菌过程中的人为误操作概率，增加发酵生产的风险。在使用蒸汽灭菌的过程中会产生较大噪音，操作工也会有烫伤的危险，为了实现自动化操作，减少人为误操作，提升职业卫生水平，很多企业开始尝试灭菌的自动化控制[1]，使生物发酵向更高的自动化方向发展。如连消系统的整体模块化，使整个连消过程实现完全的自动化过程[2]。更有企业将自动化水消系统推广无菌管路以及发酵罐的灭菌过程中[3]。因此在现代化企业的发酵生产中，需要设计一种一键式自动化程序灭菌方法（以下简称“一键式灭菌”），使其实现一键式控制模式，从而提高生产的效率和准确性，提升职业卫生水平。

1 发酵生产中的灭菌工艺

发酵过程中生产菌种与培养基直接接触混合，需要一个无杂菌生长的环境，因此接种前培养基的灭菌对发酵效率及产品的技术经济指标至关重要。

发酵过程，多使用液体培养基。生产过程中，液体培养基的灭菌方式主要有分批灭菌法（下称“实消”）和连续灭菌法（下称“连消”）[4]。在连续灭菌生产中还需要首先对发酵罐罐体进行空罐灭菌（下称“空消”）。

1.1 实消工艺

分批灭菌也称实罐灭菌或实消（以下简称实消），指将配制好的培养基全部输送至发酵罐后，通入蒸汽直接加热，再冷却至接种温度的灭菌过程。此过程的加热、维持保温和冷却三个阶段均在发酵罐中完成。

实消灭菌过程[5-6]（以种子罐为例）：

（1）进料。打开进料及排气管路上的阀门，用泵将配制好的培养基从配制罐输送到种子罐，进料完毕关闭进料阀门，开启搅拌器搅拌或通入空气防止料液沉积。

（2）升温。将蒸汽从种子罐的物料进口、出口、压缩空气进口、取样口等罐内液面以下管口通入，通过控制排气阀门开度控制罐压，将罐压维持在0.09～0.1 MPa（表压），罐温逐渐升高。

（3）保温。待罐温升高至119～121℃，调节蒸汽进汽量维持罐压、罐温稳定，保温30 min 左右，保温过程中开动搅拌。

（4）降温。保温结束后，关闭蒸汽进汽阀、排气阀，开启压缩空气进气阀，通入压缩空气，并开始在夹套中通入冷却水或低温水将培养基降至培养温度，灭菌过程结束。

1.2 连消工艺

连续灭菌也称连消，指将培养基在发酵罐外，通过专门灭菌装置，连续在不同设备中分别进行加热、维持保温和冷却，然后进入发酵罐的灭菌过程。

连消灭菌过程（以发酵罐为例）：

培养基泵入加热器，在15～30 s 之内被快速加热至灭菌温度130～140℃，进入维持器维持5～8 min，然后在冷却器中冷却至40～50℃，最后输送至已灭菌的发酵罐中。

连消后培养基所进的发酵罐，必须提前进行空罐灭菌，即空消。空消一般维持罐压0.15～0.2 MPa（表压），罐温为125～130℃，时间为30～45 min。灭菌后为避免罐压急剧下降造成负压，通压缩空气保压，待经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，方可开冷却水冷却。

连消主要用于大规模发酵生产的液体培养基的灭菌，已在维生素C、谷氨酸等工业中广泛应用。

以上两种灭菌工艺的操作为较传统的人工控制，即在发酵现场人为操作各个蒸汽阀门的开闭来实现复杂的过程。较为先进的企业，将蒸汽控制阀门设置为自控阀，在控制室进行人工控制，这样虽然能将操作人员从现场调离，但却不能省去复杂的操作过程，因此设计一套通过逻辑控制编程实现的一键式灭菌方案尤为重要。

2 一键式程序灭菌

一键式灭菌是将整个发酵系统的操作过程通过逻辑控制编程后，汇总到一个按键来触发整个过程，整个过程由计算机程序化控制。

现以具体工程为实例，对一键式灭菌方式进行介绍。由于本工程中种子罐实消与发酵罐的空消生产及控制方式相同，故省略种子罐的消毒介绍，直接以发酵罐的空消、种子罐向发酵罐移种的移种站灭菌为例，叙述一键式灭菌的控制步骤。

2.1 发酵罐（空消）与移种系统的一键式灭菌

2.1.1 发酵罐（空消）

灭菌控制自控阀门设置如图1所示。

图1 发酵罐的一键式灭菌Fig.1 One key sterilization of fermentation tank

进培养基管路上设计运程开关阀HS0。空气精过滤器后进蒸汽管道设计远程开关阀HS1和调节阀TV1，调节阀TV1 与罐温联锁，取样口蒸汽进口设远程开关阀HS2。空气精过滤器后空气管道设计远程开关阀HS3。排气管道设计调节阀PV1、PV2 与罐压联锁。冷却水管道自控阀TV2、TV3 与罐温联锁。

一键式灭菌过程如下：

连消后培养基进入发酵罐之前，需要对发酵罐进行空消。关闭罐与外界相连管道上的全部阀门。DCS打开HS0、HS1、HS2、HS3、HS4、TV1、 蒸汽输入罐内加热罐体，罐内空气通过PV2 排出，罐体温度升高至100℃时，关闭PV2，切换开启PV1。通过蒸汽管调节阀TV1 与罐温连锁、排气开关阀PV1 与罐压连锁，控制罐压维持在0.09～0.1 MPa（表压），罐温逐渐升高至119～121℃，并维持罐压、罐温稳定，保温30 min。

保温结束后，远程自动关闭蒸汽进汽阀HS1、HS2、HS4，停止蒸汽对种子罐的热量提供。开启冷却水管开关阀TV3、TV4，调节阀TV2，给罐体降温，开启压缩空气进气阀HS3，通入经除菌过滤的压缩空气后，罐压连锁开启PV2；待罐温降至培养温度后，空消灭菌过程结束。

2.1.2 移种系统

灭菌自控阀门设置如图2所示。

图2 种子罐到发酵罐移种系统的一键式灭菌Fig.2 One key sterilization of seed tank to fermentor transfer system

此系统为连接种子罐与发酵罐的移种系统。系统中移种总管一端设置蒸汽进气灭菌，并设有开关阀HS1和调节阀HS2。

正常工作时，先用蒸汽将移种总管灭菌，一键式自控程序自动打开蒸汽自控开关阀HS1和调节阀HS2，蒸汽通过移种总管到末端管道排气出口排出。整个总管灭菌20 min 后，关闭末端自控阀，处于消后待用状态。发酵罐空消时，打开对应的三通隔膜阀HS4，蒸汽吹到相应的发酵罐中，配合发酵罐的空消。

根据以上叙述过程，将各个系统自控阀控制方式相配合，在控制室DCS中编程，形成一键式自动化灭菌程序。整个过程实现一键式程序自动控制，无需人为操作和干预，从而可以降低灭菌过程中人为误操作，提高灭菌过程的准确性。

2.2 一键式灭菌与传统灭菌方式的对比

2.2.1 降低灭菌操作的复杂性，减少人为误操作，提高灭菌效率

由于发酵生产的特性，发酵罐与外界的连接主要包括：发酵培养的空气管路、输入种子液和发酵培养基的物料管路、灭菌时排蒸汽管路、培养时的取样口、发酵完成后的发酵液放料管路。以上接口在发酵培养之前均需用蒸汽灭菌至无菌级别，故需对以上接口依次进行灭菌。传统的人为操作灭菌过程，极易造成生产的不利后果。如图1，灭菌时的排蒸汽管路阀门PV1 开度过大会造成蒸汽用量增大或发酵罐灭菌压力偏低；在灭菌后的降温过程中，空气阀门HS3开度过低，或者空气阀门HS3 打开不及时而造成发酵罐的真空，从而造成发酵罐的瘪罐现象；灭菌过程要求灭菌工人依次顺序开启和关闭多个灭菌阀门，使得灭菌时间延长从而导致灭菌效率降低。而在一键式灭菌程序中，由于提前在计算机中设置阀门连锁开启和关闭程序以及各个阀门的开度，程序式灭菌过程会依次有序进行，从而避免以上传统式发酵灭菌生产中会出现的能耗增大、瘪罐以及灭菌时间延长的不利后果，从而降低灭菌操作的复杂性，减少人为误操作并提高灭菌的生产效率。

2.2.2 降低劳动强度，减少人员成本，避免操作中的烫伤风险及噪声危害

随着发酵产能的增大，发酵罐的体积也随之增大，例如某发酵生产工厂的发酵罐高达18 m，穿越三层楼板，如图1，需要灭菌的管路阀门HS3，HS0，HS4 分别分布在不同的楼层，在传统手动灭菌时，就需要灭菌工人穿梭在不同楼层进行操作，无形中增大了灭菌工人的劳动强度；并且在蒸汽灭菌时，由于高温蒸汽与低温物料的混合，产生的极大噪声也会造成灭菌工人的职业危害。一键式灭菌，可以计算机程序式连锁，触发后消毒程序自动进行，无需灭菌工人现场操作，从而降低了劳动强度，减少人员成本，避免了灭菌操作过程的烫伤风险和噪声。

2.2.3 减少物料在管路中的残余，降低染菌风险，提供新颖工程设计思路

在传统的发酵生产工程设计中，为了减少2.2.2中所叙述的灭菌工人的劳动量，在设计时，往往会将图1中的HS0，HS4 人为与HS3 同层安装，这时就增加了进料和出料管的长度和U 形弯，造成在进料、移种、出料时的管路存料现象，从而导致物料浪费并增加染菌风险。一键式灭菌的设计，可以避免人员现场操作，从而取消HS0，HS4 与HS3的同层安装设计，避免物料在管路中的残余。并且移种管路中三通隔膜阀的使用进一步减少了移种时种子液在管路中的残余，从而降低染菌风险。此种管路设计为以后的发酵生产设计提供了新颖的思路。

一键式灭菌方法与传统灭菌方法的优缺点对比如表1所示。

表1 一键式灭菌方法与传统灭菌方法的优缺点对比Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages between one key program sterilization method and traditional sterilization method

3 结束语

随着发酵生产的大规模扩大，发酵过程的自动化也在飞速发展。本文介绍的一键式灭菌方案与传统的人工现场灭菌或人工手动控制室灭菌方法相比，能够减少发酵生产中灭菌过程的人为误操作；减少人员劳动成本；提高发酵的生产效率。而且在工作环境方面，可以在极大程度上降低蒸汽噪声、蒸汽烫伤对消毒操作工的危害。

另一方面，本文对发酵罐、移种系统的一键式灭菌方案的介绍，能够为后续发酵车间的灭菌设计提供一条重要思路。