纳米白藜芦醇脂质体的制备及分配系数测定

张茹，元琳琳，孙凯玥，王珊，耿丽娜,＊，张建军

1河北师范大学化学与材料科学学院, 石家庄 050024

2河北师范大学分析测试中心, 石家庄 050024

1 引言

白藜芦醇(3,4’,5-三羟基-1,2二苯乙烯)是一种天然存在的多酚和植物抗毒素，广泛存在于葡萄、浆果、花生等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗癌和神经保护等作用1,2。Mohamed等3综述了白藜芦醇在直肠癌和皮肤癌预防和治疗中的作用。Jang等4报道了白藜芦醇的抗白血病特性，并对其生物学和药理活性进行了大量的研究5。然而，白藜芦醇难以通过高选择性的血脑屏障(blood brain barrier,BBB)，在中枢神经系统疾病中的生物效率不太理想，脑内生物利用度低6。

脂质体作为近几年新出现的一种药物载体，无毒、无免疫原，主要由磷脂双层膜组成，具有类细胞结构，双层膜中含有亲水分子和亲脂分子7，具有靶向性、低毒性、生物相容性和长效缓释性等诸多优点8。研究发现，经脂质体包封，可改善药物的理化性质，提高其稳定性和生物利用度9。Kristl等10研究发现白藜芦醇脂质体能够延缓药物释放，细胞吸收明显增强，并能有效避免自由基的损伤。Ethemoglu等11研究发现脂质体包封可以改善癫痫大鼠脑内游离白藜芦醇的作用，使白藜芦醇的抗氧化和抗癫痫特性有所提高。王宏雁等12采用逆向蒸发法制备了白藜芦醇纳米脂质体，发现其抗氧化能力良好并且对DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)具有明显的清除作用。王彦春等13发现，白藜芦醇脂质体比其纯药溶剂对帕金森模型大鼠黑质细胞的保护作用更强。

一般来说，药物从脂质体释放取决于动力学因素，如药物渗透性和热力学参数。脂质体研究过程中，经常使用油-水(正辛醇-水)分配系数(Po/w)来预测药物的包封率以及载药量14。邓英杰等15以正辛醇-水分配系数来模拟物质在体内水相和生物相的分配情况，预测药物在体内的吸收情况。这种方法以研究药物的亲脂性为主16，反映药物的疏水作用而忽略生物膜的生物学特性17。而脂质体-水分配系数(Plip/w)能模拟生物膜的结构18，预测药物在生物膜中的的分配情况，反映在体内药物与生物膜(磷脂双分子层)间的作用情况，如疏水性、静电力和氢键等药物与生物膜之间的综合作用19。因此，国内外学者在研究中也同样使用脂质体-水分配系数来表征药物在生物膜中的分配情况20。Chavez-Capilla等21利用脂质体-水分配系数判断砷类化合物通过细胞膜的能力，更加精准地评估了三价砷和硫砷化物对人体的危害。Esteves等22将脂质体-水分配系数作为预测人体药物吸收的生物模型。Ikonen等23建立了测定脂质体-水分配系数的电化学方法，可更加精准地测定样品中磷的含量。油-水分配系数和脂质体-水分配系数不仅可单独用于测定药物在生物膜的分配情况，一些学者在研究中采用两者结合的方法综合了判断了药物于生物膜之间的作用情况。陆伟根等24测定了Po/w和Plip/w随体系pH值的变化情况，发现两者均随体系pH的增加而增大，初步判断草乌甲素与磷脂膜之间以疏水作用为主。钟海军等25通过对比灯盏花素Po/w和Plip/w随体系pH的变化趋势，发现两者正好相反，表明药物与磷脂膜之间的作用力以氢键、静电力等为主，而疏水作用为辅。

我们的前期工作已经测定了柠檬酸铁脂质体(FAC-Lip)和血红素铁脂质体(Heme-Lip)的脂质体-水分配系数、药物与脂质体膜层之间的作用力类型及吉布斯自由能26。在此基础上，我们制备了纳米白藜芦醇脂质体(RES-Lip)，测定RES-Lip的Po/w和Plip/w，观察药物在生物膜表面分配情况并分析药物与脂质体膜的作用力类型及吉布斯自由能。研究结果可指导纳米脂质体的合成，预测药物的体外释放及体内吸收，并为在体实验提供实验指导。

2 实验部分

2.1 材料与主要仪器

白藜芦醇(纯度 ＞ 98%)，上海源叶生物科技有限公司；大豆卵磷脂(PC，纯度 ＞ 75%)，北京源华美磷脂科技有限公司；胆固醇(chol，纯度 ＞ 95%)，上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，生物科技发展有限公司。RE-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；微量移液器，德国Eppendorf公司；CPS2超声波粉碎机，宁波新芝超声有限公司；85-2恒温磁力搅拌器，常州澳华仪器有限公司；TGL-18-B高速离心机，湖南星科科学仪器有限公司；U-3010紫外-可见分光光度计，日本日立公司；JEM100SX透射电子显微镜(TEM)，日本日立公司。

2.2 RES-Lip的制备

采用旋转薄膜蒸发-超声法制备纳米白藜芦醇脂质体(RES-Lip)混悬液。按照一定膜材比：卵磷脂和胆固醇质量比(mPC:mChol= 5 : 1，8 : 1，10 :1，12 : 1)、药脂比(RES与卵磷脂质量比：mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)准确称量，加入适量无水乙醇将其溶解，待其完全溶解后转移至圆底烧瓶，置于45 °C旋转蒸发仪上旋转蒸发，直至乙醇完全挥发并形成均匀透明的薄膜。量取磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 7.4) 10 mL，倒入上述圆底烧瓶中进行水化洗膜，即可得到RES-Lip混悬液。水浴超声处理，再将混悬液至于透析袋中，避光透析，除去未包封的RES，所得产物RES-Lip密封保存于4 °C的冰箱中备用。

2.3 RES-Lip的形貌及粒径分布

用移液枪吸取1滴已稀释的新制备的RES-Lip混悬液，滴在镀膜的铜网表面，自然晾干，再用4%磷钨酸溶液对脂质体进行负染30 s，最后将晾干的铜网放在透射电镜下观察RES-Lip微观形貌。

用二次水将RES-Lip稀释10倍，超声后使用激光粒度仪测粒径。

2.4 RES-Lip包封率的测定

首先配制一系浓度梯度的RES标准溶液，用紫外分光光度计测在其最大吸收波长306 nm处的吸光度，绘制成吸光度与浓度的标准曲线。

取RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC=1 : 40)透析液，用紫外分光光度计测其在306 nm处的吸光光度值，代入标准曲线方程计算相应的RES含量。按(1)计算RES-Lip的包封率(EE%)。

2.5 RES-Lip平衡时间的测定

对2.2节中制备的RES-Lip进行平衡透析，测定不同时间t下透析液中RES的浓度，得到平衡曲线，确定平衡时间。

2.6 RES-Lip脂质体-水分配系数的测定

按文献26的方法，取适量的RES-Lip放入透析袋，采用平衡透析法，室温测定透析液中RES的浓度，按公式(2)求算lgPlip/w值。

其中Vl为 RES-Lip的体积(L)，C1是RES-Lip包封的质量浓度(g·L−1)，C2是透析液中RES的质量浓度(g·L−1)，VL是脂质体磷脂双分子层的体积(L)，此值按文献27计算，lgPlip/w为RES的脂质体-水分配系数的对数值。

2.6.1 膜材比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

按2.2节的方法制备不同膜材比(mPC:mChol=5 : 1，8 : 1，10 : 1，12 : 1)的RES-Lip，按上述方法分别求算其对应的lgPlip/w。考察膜材比对RESLip脂质体-水分配系数的影响。

2.6.2 药脂比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

按2.2节的方法制备不同药脂比(mRES:mPC=1 : 25，1 : 40，1 : 50，1 : 60)的RES-Lip，按上述方法分别求算其对应的lgPlip/w。考察药脂比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响。

2.6.3 pH值对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

等体积量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-Lip放入透析袋中，按上述方法分别求算其对应的lgPlip/w。

2.7 RES-Lip油-水分配系数的测定

将文献24中的测定方法略加改动，等体积量取不同pH值(4.50、5.01、5.62、6.02、6.50、7.02、7.41、8.03)的RES-PBS缓冲溶液和相应pH的正辛醇在小烧杯中混合，磁力搅拌2 h，室温放置30 min，取下层水相离心15 min (离心力2000g)。用紫外分光光度计分别测定分配前后水相中RES的浓度，二者之差即为RES在正辛醇相中的浓度。按公式(3)计算lgPo/w值。

图1 RES-Lip的透射电镜图(a)和粒径分布(b)Fig. 1 TEM images (a) and size distribution (b) of RES-Lip.

其中Co和Cw分别代表RES分配在油水两相中的质量浓度，lgPo/w即为油-水分配系数对数值。

2.8 RES与脂质体膜层之间吉布斯自由能的测定

按文献26,28记载的方法，在25 °C条件下，检测透析平衡时脂质体中药物浓度和透析液中的药物浓度，按公式(4)、(5)计算药物与脂质体磷脂双分子层之间的吉布斯自由能(ΔG)：

其中Kapp是表观常数，Xb是平衡时脂质体中药物浓度(mg·mL−1)，Pf是平衡时透析液中的药物浓度(mg·mL−1)，z是药物所带的电荷(C)，F是法拉第常数(C·mol−1)，Ψ是脂质体zeta电位(mV)。

3 结果与讨论

3.1 RES-Lip的形貌及粒径分布

图1a为RES-Lip的透射电镜图，从图中可以看出，脂质体为球形囊泡，分散较为均匀，并且脂质体的粒径大部分在100 nm以下。研究表明，与粒径为1-100 μm的普通脂质体相比，小粒径(＜ 200 nm)的脂质体在穿透性能和体内被动靶向性等方面具有更大的优势29。

图1b为RES-Lip的粒径分布图，由图可知，RES-Lip的粒径为100 nm左右，与图1a结果一致。

3.2 RES-Lip的工作曲线和包封率

用紫外分光光度计测在其最大吸收波长306 nm处的吸光度，绘制成浓度与吸光度的标准曲线如图2所示，由图2看出RES 的工作曲线方程为A=0.1192C− 0.01171，R2= 0.9994即在0.1500-15.0000 μg·mL−1范围内有良好的线性关系，根据公式(1)就算出RES-Lip (mPC:mChol= 10 : 1，mRES:mPC= 1:40)的包封率为90.72 ± 1.24。

3.3 RES-Lip的平衡时间

图2 RES-Lip的标准曲线Fig. 2 Standard curve of RES-Lip.

图3 RES在脂质体-水相中平衡分配时间Fig. 3 Equilibrium partition time of RES in the phases of liposome and water.

测定不同时间时透析液中RES的浓度，得到RES-Lip在脂质体-水相中平衡曲线如图3所示，开始时RES浓度波动较大，但随着时间的延长，4 h后RES浓度波动逐渐减小，呈基本稳定的状态，因此认为当t≥ 4 h时，RES-Lip在脂质体-水相中达到平衡。

3.4 RES-Lip脂质体-水分配系数的测定

3.4.1 膜材比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

图4为膜材比不同时RES-Lip的lgPlip/w，从图中可以看出，随着膜材比的增加lgPlip/w值呈现先增大后减小的趋势，这是由于加入适量的胆固醇提高了RES-Lip的稳定性，减少药物的泄露；但胆固醇的含量过高，会使脂膜刚性增加，排列紧密30,31，药物难以进入脂质体磷脂双分子层中，因此lgPlip/w会减小。从图上可以看出，当膜材比分别为10 : 1，RES-Lip的lgPlip/w最大，说明此时药物与磷脂膜之间的作用力也最大。

3.4.2 药脂比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

图5为药脂比不同时RES-Lip的脂质体-水分配系数lgPlip/w。从图中可以看出，随着药脂比的增加lgPlip/w呈现先增大后减小趋势。这是因为在其他条件固定的情况下，随着药物的增加，可以进入脂质体双分子层的药物也随之增加了；当药物量达到一定时，脂质膜层的包封量达到最大，药物不能继续分配进入脂质体膜层中。药脂比为1 : 40时，lgPlip/w最大，说明此时药物与磷脂膜间的作用力最大。

3.4.3 pH对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响

图6a为RES-Lip在不同pH缓冲溶液中的脂质体-水分配系数lgPlip/w，从图中可以看出，lgPlip/w随体系pH的增加而减小，即RES在脂质体中的分配减小，当体系的pH在5-7.5之间时lgPlip/w变化比较缓慢，说明这个范围有利于制备RES-Lip。Plip/w反映的是多种力的综合作用，包括疏水作用、氢键、静电作用等。为了能更加准确的判断RES与磷脂膜之间的作用力类型，我们还测定了RES的油-水分配系数。

图4 膜材比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响Fig. 4 Effect of membrane material ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

图5 药脂比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响Fig. 5 Effect of lipid to drug ratio on the liposome/water partition coefficients of RES-Lip.

图6 RES-Lip的脂质体-水分配系数lgPlip/w (a)和油-水分配系数lgPo/w(b)随pH的变化趋势Fig. 6 The trend of liposome/water coefficients lgPlip/w(a) and the n-octanol/water coefficients lgPo/w (b) of RES-Lip with pH.

3.5 RES油水分配系数的测定

图6b为RES的油-水分配系数随lgPo/w随pH的变化趋势，由图可知，RES的lgPo/w随pH的增加而减小，即lgPo/w和lgPlip/w变化趋势相同，由于lgPo/w主要反映的是疏水-疏水相互作用，与文献24结果一致，所以可以说明RES与磷脂双分子层的作用力以疏水作用为主，而氢键和静电作用等其他作用为辅。

表1 透析平衡时RES-Lip的相关参数及ΔGTable 1 The parameters and ΔG of RES-Lip at dialysis equilibrium.

3.6 RES与脂质体膜层之间吉布斯自由能的测定

由图3可知，平衡透析4 h时，RES在脂质体-水相中达到平衡，此时RES-Lip的相关参数Xb、Pf、T、Ψ见表1，将其带入公式(4)、(5)中可得RES-Lip中药物与脂质体膜之间的吉布斯自由能(ΔG)为−17.07 kJ·mol−1。与我们前期所测定的FAC-Lip和Heme-Lip中药物与脂质体膜的吉布斯自由能(−12.7 kJ·mol−1和−18.2 kJ·mol−1)结果类似26。Russell28和全东琴32等研究表明，药物与磷脂双层膜之间吉布斯自由能的大小能反映药物与膜之间结合的难易程度，ΔG越小，体系越稳定，药物与磷脂膜越容易结合。因此，表明在我们的实验条件下，RESLip的制备比较容易。

4 结论

本实验采用薄膜旋转蒸发法-超声法成功制备了纳米白藜芦醇脂质体(RES-Lip)，并对产物进行表征，探究了体系pH值、膜材比和药脂比对RES-Lip脂质体-水分配系数的影响、药物与脂质体膜之间的作用力类型和吉布斯自由能。结果发现，随着膜材比和药脂比例的增加，lgPlip/w均呈现先增大后减小的趋势；而随着pH的增加lgPo/w和lgPlip/w均呈减小趋势，说明RES与磷脂膜之间的作用力以疏水作用为主。并且当膜材比为10 : 1，药脂比为1 : 40时，lgPlip/w最大，说明此时RES与磷脂膜间的疏水作用力最大。通过计算得到RES-Lip中RES与磷脂膜之间的吉布斯自由能为−17.07 kJ·mol−1，这表明RES容易包封到脂质体中。本实验可为载药脂质体的制备、体外释放及药物在生物体的药代动力学研究提供参考。