炎症微环境对大鼠间充质干细胞增殖及Sirt6 表达水平的影响

王 开， 荆得宝， 于素平， 刘雪阳

（第二军医大学附属公利医院口腔科，上海 200135）

炎症性吸收是导致颌骨缺损的主要因素之一。颌骨缺损、 牙齿缺失往往伴有衰老趋势的出现，这不仅影响咀嚼功能和身心健康，甚至会诱发其他的系统性疾病。 如何重塑颌骨形态、抑制炎症性吸收，具有重要意义。 骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种具有多向分化潜能的细胞，可以通过体外诱导定向分化为成骨细胞，成为骨形成的基础，为研究颌骨重塑提供了可靠的来源。

Sirt6 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白，是沉默配型信息调节蛋白家族（Sirtuin）的重要成员。 研究表明，Sirt6 不仅具有调节炎症反应的作用， 而且对多种细胞具有抗衰老的作用[1-4]。研究证明，Sirt6 是破骨细胞的抑制因子， 但是具体的发病机制尚不明确。 本研究基于牙周病的高发病率和颌骨破坏导致炎性衰老， 甚至会诱发其他系统性疾病为背景， 探讨炎症状态下，Sirt6 在大鼠BMSCs 中定向分化成骨中的作用， 为Sirt6 是否可作为靶向因子促进成骨提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3～4 周龄SD 大鼠2 只，体质量为250～300 g/只，雌雄不限，由同济大学实验动物中心提供。

1.2 实验试剂及仪器

DMEM 培养基（Gibco 公司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司， 中国），L-抗坏血酸400 μL（Sigma公司， 美国），β 甘油磷酸钠2 mL （Sigma 公司，美国），地塞米松20 μL（Sigma 公司，美国），ELISA 检测试剂盒（Sigma 公司，美国），低温冷冻离心机（卢湘仪离心机仪器有限公司， 中国）， 酶标仪（BMG LABTECH 公司，德国），Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo 公司，美国），倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本），RT-PCR 荧光定量仪（ABI 公司，美国）。 本实验完成于第二军医大学附属公利医院中法合作中心实验室。

1.3 实验方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs体外分离培养与鉴定 取SD 大鼠1 只，颈椎脱臼法处死，浸泡于75%乙醇中约5～10 min， 无菌手术器械取出双侧股骨及胫骨，去除附着肌肉，将其浸泡于适量培养基中。 针筒吸取适量培养基插入一端干骺端，将骨髓中细胞冲至培养皿中，反复几次，直至股骨及胫骨发白。 收集此细胞悬液，用200 滤网过滤，去除稍大的杂质，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，800 r/min 离心5 min，弃上清液，加入适量DMEM 培养基混匀后接种于培养瓶中培养，37 ℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养48～72 h，更换培养基，注意动作轻柔。此后每隔3 d 更换培养基1 次。于9～12 d 后形成多个细胞集落， 长满瓶底约70%～80%后用0.25%胰酶消化，1∶2 传代培养[5-6]。流式细胞仪检测CD34、CD40、CD90、CD29 等表面分子， 其后进行BMSCs 的诱导分化，证实其成骨细胞分化、脂肪细胞分化等干细胞特性。

1.3.2 CCK-8法检测炎症微环境下大鼠BMSCs的增殖能力 取第3 代大鼠BMSCs， 将生长至70%～80%的细胞消化，离心，稀释至1×104个/mL，在96 孔板中加入100 μL/孔细胞悬液。 实验分为对照组，实验组（LPS 诱导组、LPS 过表达Sirt6 组）。 将合成的Sirt6 质粒测序后转染入BMSCs 中， 检测转染效率满足过表达率，构建过表达Sirt6 组，对照组不加入LPS； 实验组加入浓度为10 μg/mL LPS 0.1 mL/孔。分别观察12、24、48、72 h，每组设3 个复孔。 酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A）值。

1.3.3 BMSCs体外多向分化能力的测定 取第3代生长良好的大鼠BMSCs 以1×105个/mL 的密度接种于6 孔板中，待细胞生长至70%汇合时加入成骨诱导液，21 d 后茜素红染色；成脂诱导：取第3 代生长良好的BMSCs 以1×105个/mL 的密度接种于6 孔板中， 待细胞生长至70%汇合时加入成脂诱导液，21 d 后油红O 染色。

1.3.4 免疫荧光技术检测Sirt6蛋白的分布 取第3 代大鼠BMSCs 消化，离心，稀释至1×104个/mL，然后接种在培养皿中的小盖玻片上， 对照组加少许培养液。 待细胞贴壁，加足量的干细胞培养基，实验组加入浓度为10 μg/mL LPS 2 mL， 培养72 h，用丙酮在室温下固定5 min，0.01%磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤；分别加入异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate， FITC）及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记的Sirt6 抗体30 μL，室温暗处孵育1 h，0.01% PBS 洗涤，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.3.5 ELISA检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达 用浓度为10 μg/mL 的LPS 刺激BMSCs，根据实验要求收集不同时间点（12、24、48、72 h）的细胞周围培养基，使用ELISA 试剂盒测定培养基中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。实验方法参照试剂盒说明书。 酶标仪波长450 nm 处时，读A值，根据标准品所制得标准曲线得到TNF-α、IL-1β、IL-6的含量值。

1.3.6 RT-PCR检测Sirt6的mRNA表达水平 LPS诱导组、 对照组和LPS 过表达Sirt6 组的细胞培养12、24、48、72 h 时，按照TRLzol 试剂说明书的要求提取细胞总RNA， 根据反转录试剂盒说明书要求采用特异性下游引物法反转录生成cDNA。Sirt6 上游 引 物：5'-AGGGTTGTCGCCATACGC-3'， 下 游 引物：5'-GGAGGACTGCCACATCAGC-3'；GAPDH 上游引物：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3'， 下游引物：5'-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3'。 PCR 条件为95 ℃预变性60 s；95 ℃30 s、54 ℃45 s、72 ℃60 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。检测Sirt6 的扩增效率，实验重复3 次取均值。采用2-ΔΔCt法计算mRNA 的相对表达量， 并灰度扫描进行Sirt6 表达的半定量分析。

1.3.7 Western blot技术检测BMSCs细胞中Sirt6的表达 分别于细胞培养时段12、24、48、72 h 时，收集对照组和LPS 诱导组细胞，加入去铁胺（deferoxamine，DFO）药物作用24 h，用预冷PBS 冲洗2 次，然后加入50 μL 细胞裂解液， 在振荡器上震荡数次，充分裂解后在冰上放置20 min，离心半径5 cm、12 000 r/min 离心5 min， 收集上清液行定量分析。取已定量的总蛋白进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳 （SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）实验，电转移至硝酸纤维素膜上，放入5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA），室温封闭过夜。 取出膜，于摇床上用TBST 缓冲液洗膜3 次， 每次10 min， 加入TBST 缓冲液稀释的Sirt6（Abcam 公司，1∶200），4 ℃孵育过夜。TBST 缓冲液洗膜3 次， 每次10 min， 加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 标记的羊抗兔二抗（碧云天公司，1∶2 000） 和HRP 标记的羊抗小鼠二抗（碧云天公司，1∶2 000）室温孵育2 h。 TBST 缓冲液洗膜3 次，每次10 min。 将膜置于化学发光检测试剂（试剂A∶试剂B＝1∶1）中反应2 min，取出膜，甩去多余液体，保鲜膜包好后在暗室中用X 线胶片感光、显影、定影，凝胶分析系统分析蛋白的表达。

1.4 数据分析

用GraphPad Prism 6 软件进行分析，2 组之间差异用t检验，多组间比较则采用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测BMSCs 中CD34、CD40、CD90、CD29 的表达

流式细胞仪检测结果显示：CD29 的阳性表达量＞90%，CD90 的阳性表达量＞90%； 而CD40 的阳性表达量＜5%，CD34 的阳性表达量＜5%。 此结果证明所培养的细胞为BMSCs（图1）。

2.2 CCK-8 检测不同条件下BMSCs 的增殖情况

绘制的细胞生长曲线表明， 细胞培养24 h 后，LPS 过表达Sirt6 组细胞增殖率高于LPS 诱导组及对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着时间的延长，细胞增殖均具有逐渐增加趋势，LPS 诱导组的增殖趋势逐渐平缓（图2）。

图1 流式细胞仪检测BMSCs 细胞标记物Figure 1 Expression of BMSCs markers by flow cytometry

图2 CCK-8 检测不同条件下BMSCs 的增殖曲线Figure 2 Proliferation curves of BMSCs under different conditions by CCK-8

2.3 茜素红和油红O 染色测定

成骨诱导21 d 后，镜下可见钙结节形成，证明所培养的细胞具有成骨能力（图3A）；成脂诱导21 d后，可见明显的脂滴状物形成，证明细胞也具有成脂能力（图3B）。

2.4 免疫荧光染色显示Sirt6 的表达

BMSCs 细胞爬片上，对照组DAPI 及FITC 染色结果显示Sirt6 蛋白的荧光表达分布 （图3C、3D）；LPS 诱导组DAPI 及FITC 染色结果显示Sirt6 在细胞爬片上的表达（图3E、3F），证明Sirt6 在BMSCs 细胞核上呈阳性表达。

图3 BMSCs 的成骨、成脂分化和Sirt6 的免疫荧光表达Figure 3 Osteogenic differentiation and lipogenic differentiation of BMSCs and immunofluorescence expression of Sirt6

2.5 ELISA 检测BMSCs 培养基中炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6 的表达

图4 炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达及Sirt6 的mRNA 水平Figure 4 Expression of inflammatory factors TNF-α、IL-1β、IL-6 and Sirt6 mRNA levels

如图4A～C 所示，与对照组相比，同一时间点LPS 诱导组中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量均呈现高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；随着时间的延长，TNF-α、IL-1β、IL-6表达量逐渐出现下降趋势（P＜0.05）。

2.6 RT-PCR 检测Sirt6 的mRNA 水平

同一时间段内， 相对于LPS 诱导组和对照组，LPS 过表达Sirt6 组中Sirt6 的mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），差异具有统计学意义；随着时间的推移， 不同时间点内Sirt6 的mRNA 表达水平呈现显著性升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图4D）。

2.7 Western blot 技术检测BMSCs 细胞中Sirt6 的表达

Western blot 检测结果显示， 与对照组比较，同一时间点，LPS 诱导组中Sirt6 蛋白的表达均出现下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），且随着时间的推移，Sirt6 的蛋白表达并没有出现显著性下降， 差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图5。

图5 Western blot 技术检测BMSCs 中Sirt6 的表达Figure 5 Expression of Sirt6 under different conditions by western blot

3 结论

牙周炎症的长期存在， 导致颌骨的广泛吸收、牙齿松动及脱落， 进而面容发生炎性衰老的趋势，影响咀嚼功能及全身营养吸收。 大量的研究表明，口腔炎症微环境和全身系统性疾病有着密切的关系[7-9]。 牙周炎微环境中， TNF-α、IL-1β 及IL-6 是主要的促炎因子，在炎症反应及骨病理、生理过程中起重要的作用，并且炎症因子可以通过多种复杂信号通路调控干细胞的生物学特性， 例如NF-κB、Wnt/Ca+、ATK/p38-MAPK 等信号通路。 炎症因子TNF-α 不仅可以抑制成骨细胞分化及矿化结节的形 成， 而且TNF-α 和IL-1β 在体外可以抑制BMSCs 的成脂分化能力。 本研究发现，同一时间点LPS 诱导组中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量均呈现高表达，LPS 诱导组中炎症因子抑制了BMSCs 的增殖能力。然而，也有学者认为在炎性条件下TNF-α 会刺激骨的形成，并推断TNF-α 具有不同的功能，可能与TNF-α 的干预时间或骨形成的不同阶段有关[10]。

Sirt6 是广泛存在于哺乳动物中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的一种组蛋白，是沉默配型信息调节蛋白家族(Sirtuin) 的重要成员。 研究表明，Sirt6 是炎症反应及衰老相关疾病的关键调控蛋白，Sirt6 能够与核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）的RELA 亚型相互作用， 使NF-κB 靶基因启动子上组蛋白3 的赖氨酸9 （histone H3 lysine 9，H3K9） 位点去乙酰化， 以减弱NF-κB 的信号， 减少下游炎症靶基因转录， 从而减轻细胞衰老、 凋亡及相关炎症反应等生物学效应。

Zhang 等[11]的研究发现，热量限制6 个月后的衰老小鼠在敲除Sirt6 后， 会诱发NF-κB 过度激活和细胞衰老加速。结果表明，抑制Sirt6 的表达，可以促发炎症反应，加速衰老；而过表达Sirt6 则可以抑制NF-κB 转录活性， 抑制炎症反应， 延缓衰老。Lappas 等[12]利用LPS 处理脐带内皮细胞，发现Sirt6的表达显著降低， 细胞内释放大量炎性因子（TNFα、IL-1β、IL-6）， 而过表达Sirt6 可以明显抑制炎症因子的表达。 本研究中，ELISA 实验表明，经10 μg/mL LPS 刺激后可以产生炎症微环境， 细胞内可以分泌大量TNF-α、IL-1β、IL-6， 随着时间的推移，TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达量逐渐降低，表明BMSCs具有调控炎症因子的作用；而过表达Sirt6 后，炎症微环境中的TNF-α、IL-1β、IL-6 出现了显著性的降低，说明Sirt6 蛋白具有抑制炎症因子的作用。 免疫荧光实验结果也验证了这一结论。 而炎症状态下，过表达Sirt6 则可以提高炎症状态下BMSCs 的增殖速率，说明Sirt6 也具有抑制炎性因子，并促进BMSCs 增殖的作用。Lee 等[13]在研究人关节滑膜细胞时也发现，过表达Sirt6 能明显抑制IL-1β 和TNF-α 诱发的炎症反应。

综上所述，牙周炎症微环境中大量炎性因子致使颌骨发生骨吸收与骨重塑过程。 炎症等多种因素抑制了BMSCs 的分化和增殖能力， 成骨细胞生成数量急剧下降，破骨细胞活跃，骨破坏明显。 抗衰老蛋白Sirt6 通过与NF-κB 的亚单位RelA/p65 直接结合而起到抑制NF-κB 活性的作用，从而实现抑制炎症和抵抗衰老的双重功能。 然而，BMSCs 中Sirt6 蛋白在调控并促进干细胞增殖和抑制衰老等功能方面的作用，还有待于进一步探索和验证。