Fc 受体样4 蛋白在唾液腺黏膜相关淋巴组织结外边缘区B 细胞淋巴瘤中的表达及意义

顾 挺， 张春叶， 胡宇华， 夏荣辉， 田 臻， 王丽珍， 李 江

（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院口腔病理科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011）

黏膜相关淋巴组织（MALT）结外边缘区B 细胞淋巴瘤属于成熟B 细胞淋巴瘤的一种亚型，好发于胃、肠、唾液腺、泪腺及甲状腺等部位。 不同部位的肿瘤，致病原因有所不同，如胃肠MALT 淋巴瘤常与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染有关[1]，甲状腺、唾液腺、泪腺的病变常与免疫性疾病有关[2]。与唾液腺MALT 淋巴瘤相关的免疫性疾病主要为Sjogren 综合征（Sjogren syndrome，SS），少数为类风湿性关节炎、红斑狼疮[3]等。 唾液腺MALT 常在淋巴上皮病的基础上形成，与上皮关系密切，但目前对该肿瘤中B 细胞亚群的研究较少。

Fc 受体样4（FCRL4）位于染色体1q21，属于细胞膜上的跨膜蛋白受体家族， 主要表达在记忆B淋巴细胞的表面，参与免疫调控。 在健康个体中，其主要存在于扁桃体隐窝上皮附近[4]，与上皮关系密切。 近年来的报道发现，FCRL4 蛋白在边缘区淋巴瘤中有较高的表达，被认为是一个较有价值的诊断性标记物[5]。BLEL 作为唾液腺MALT 淋巴瘤的前驱病变，其基本构成为淋巴组织和增生上皮岛。 有研究报道，表达FCRL4 的B 淋巴细胞（FCRL4+的B 淋巴细胞）与BLEL 中淋巴上皮结构的形成有关[6]，提示FCRL4+的B 淋巴细胞与病变发生有一定关系。 MALT 淋巴瘤病变发生早期，肿瘤细胞总是位于增生上皮岛内或紧邻上皮岛的周边，FCRL4+B 淋巴细胞在其中所起的作用还不得而知， 目前尚未见大样本唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 表达状况的研究。 本研究应用IHC 法检测MALT 淋巴瘤中FCRL4蛋白的表达，初步探讨其与肿瘤发生的关系。

1 资料和方法

1.1 标本来源及制备

从上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科病例库中筛选2005—2013 确诊为唾液腺MALT 淋巴瘤的病例，收集患者的临床病理资料，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、是否合并SS等， 参考第8 版《美国AJCC 癌症分期手册》 中的Lugano 分类法进行临床分期[7]，并对患者进行随访。同时， 随机选取10 例唇腺BLEL、20 例大唾液腺BLEL、30 例颌面部DLBCL 作为对照组。 所有标本均经10%甲醛溶液固定，常规HE 染色。 所有唾液腺MALT 淋巴瘤病例均经2 位高年资病理科医师复片，诊断依据《WHO 头颈肿瘤分类》（第4 版）[8]。HE 染色见淋巴上皮病上皮岛内及上皮周边少量较一致的小至中等大小的淋巴细胞浸润，肿瘤淋巴细胞IHC 染 色 表 达B 细 胞 标 记 物CD20、CD79α、PAX5 等，但需要除外其他小B 细胞肿瘤，如套细胞淋巴瘤表达CD5 及CyclinD1，小淋巴细胞淋巴瘤表达CD23， 不表达Bcl-6、CD10 等生发中心的标记物。 对于IHC 不能明确诊断的病例，进一步行B 细胞克隆性基因重排检测。

1.2 免疫组织化学检测

免疫组织化学染色方法采用EnVisionTM二步法，EDTA 抗原修复液修复， 所用一抗为羊抗人FCRL4（1∶60，R&D systems 公司，美国）多克隆抗体，二抗为兔抗羊二抗（1∶100，Absin 公司，中国）。

以PBS 代替一抗作为阴性对照，以扁桃体组织作为阳性对照。

1.3 结果判定

根据FCRL4 表达的定位，以细胞膜和细胞浆上出现棕黄色颗粒判断为阳性。 由2 名高年资病理医生采用双盲法读片分析，免疫组织化学结果采用染色指数（staining index，SI）判定。 高倍镜下随机选取5 个病变视野，每个视野计数100 个细胞。阳性比率评分按阳性细胞数的百分比计算：0 分=0%～5%；1 分=6%～25%；2 分=26%～75%；3 分=76%～100%；染色强度分级：0 级=无；1 级=弱阳性；2 级=阳性；3 级=强阳性。 SI＝阳性比率评分×染色强度的值，0 分为阴性；1～3 分为低表达；4～9 分为高表达。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 17.0 软件包进行统计学分析。 用χ2检验对FCRL4 在对照组、实验组中的表达及FCRL4 的表达与临床病理指标之间的关系进行统计分析。用Kaplan-Meier 分析FCRL4 蛋白表达与患者总体生存率之间的关系。P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征

共收集到72 例唾液腺MALT 淋巴瘤，其中男性19 例（19/72，26.39%），女性53 例（53/72，73.61%），男女之比为1∶2.8。 确诊时患者的年龄为5～86 岁，平均年龄54 岁，中位年龄57 岁。 肿瘤最常见于腮腺，其次为腭部、下颌下腺，其他部位包括口底、唇、舌下腺、舌根、咽旁等。33.33%的患者确诊时患有SS。所有患者中，Lugano 分期为IE 期的为61 例，IIE 期为9 例，IV 期为2 例。术后29 例患者行放化疗。详见表1。

表1 72 例唾液腺MALT 淋巴瘤的临床病理资料Table 1 Clinicopathological characteristics of MALT lymphoid of salivary gland

对所有患者进行随访， 共收集到68 例患者的随访资料，随访率为94.44%。 随访时间为57～160 个月，平均随访时间为80 个月。其中，复发9 例（13.24%），8 例为MALT 淋巴瘤， 部位为唾液腺（6 例）、颈部（1 例）及肺部（1 例）；1 例复发后进展为DLBCL，位于胃部。 复发时间为9～72 个月，平均复发时间为27 个月。其中9 例患者死亡，3 例死于非肿瘤相关的疾病，6 例死亡原因不明。

2.2 唾液腺MALT 淋巴瘤、 唇腺BLEL、 大唾液腺BLEL 及颌面部DLBCL 中FCRL4 蛋白的表达情况

所有病例FCRL4 蛋白表达情况见表2，阳性部位主要定位于淋巴细胞的细胞膜及细胞浆。 唾液腺MALT 淋巴瘤中，68 例（68/72，94.44%）检测到FCRL4蛋白表达，其中40 例（40/68，58.82%）低表达，28 例（28/68，41.18%）高表达。唾液腺MALT 淋巴瘤中，阳性细胞主要集中在上皮岛周围及上皮岛内的淋巴细胞，其他部位阳性细胞较少，且上皮岛周围及上皮岛内的淋巴细胞的表达强于其他部位的淋巴细胞（图1）。

表2 唾液腺MALT 淋巴瘤、唇腺BLEL、大唾液腺BLEL 及颌面部DLBCL 中FCRL4 的蛋白表达（例）Table 2 The comparison of expression of FCRL4 in MALT lymphoma of salivary gland, BLEL of labial gland, BLEL of salivary gland and maxillofacial DLBCL(case)

对照组中，33%（3/10） 的唇腺BLEL 中存在FCRL4 表达，均为少量淋巴细胞低表达，且主要是导管周围的细胞（图2A、2B）；50%（10/20）的大唾液腺BLEL 中存在FCRL4 表达，其中，低表达9 例，高表达1 例，表达主要定位在上皮岛内、周边及其导管上皮周边的淋巴细胞，且阳性表达细胞较少（图2C、2D）；在10%（3/30）的DLBCL 淋巴细胞中检测到FCRL4 表达，均为低表达（图1D）。

2.3 统计分析

χ2检验结果显示， 唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 的表达显著高于唇腺BLEL（P=0.013）、大唾液腺BLEL（P=0.003）及颌面部DLBCL（P=0.001），具体见表2。唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 蛋白的表达与患者年龄、性别、部位、是否合并SS 等临床病理指标之间均无统计学相关性（P＞0.05）。 Kaplan-Meier 法分析结果显示，FCRL4 蛋白表达与患者总体生存率之间无统计学意义（P＞0.05）。

图1 FCRL4 在唾液腺MALT 淋巴瘤及颌面部DLBCL 中的表达Figure 1 The expression of FCRL4 in salivary gland MALT lymphoma and maxillofacial DLBCL

图2 FCRL4 在唇腺BLEL 及大唾液腺BLEL 中的表达情况Figure 2 The expression of FCRL4 in BLEL of labial grand and salivary gland

3 讨论

本研究首次对唾液腺MALT 淋巴瘤临床大样本中FCRL4 蛋白表达情况进行了检测，同时与唇腺BLEL、 大唾液腺BLEL 及颌面部DLBCL 中的表达进行了对比， 发现唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4的表达明显高于对照组， 提示FCRL4+B 淋巴细胞与肿瘤发生有一定关系， 且FCRL4 表达在唾液腺MALT 淋巴瘤的诊断中有一定参考价值。

FCRL4 蛋白特异性地表达在一种记忆B 细胞亚群的表面，该类细胞可以特征性地过表达某些细胞表面分子，如趋化因子受体1（C-C motif receptor 1，CCR1）、 趋化因子受体5 （C-C motif receptor 5，CCR5）、 转录因子SOX5、RUNX1 （runt-related transcription factor 1）等均参与免疫调控。正常人体组织中，FCRL4+的B 细胞主要位于扁桃体隐窝上皮内及附近，具有一定的亲上皮性，而在无上皮岛的淋巴组织中非常罕见。 但是当个体存在免疫系统被慢性激活的疾病如丙肝[9]或者类风湿性关节炎[10]时，FCRL4+的B 细胞可以在外周血、滑膜液等中出现，提示该类细胞亚群与免疫性疾病有关。 BLEL 是一种与免疫系统关系密切的疾病，其基本病变构成为增生淋巴组织和上皮岛。 有研究发现，FCRL4 特异性地在BLEL 上皮岛周边表达， 呈明显的上皮趋向性， 提示FCRL4+的B 细胞与淋巴上皮结构的形成有关[6]。 进一步的研究发现，FCRL4+的B 细胞具有趋上皮性的机制是由于增生上皮岛的细胞可以产生趋化因子5 （chemokine 5，CCL5） 募集表面高表达CCL5 受体（CCR5）的FCRL4+B 细胞[11-13]。 我们的结果也证实在唾液腺MALT 淋巴瘤及淋巴上皮病变中，FCRL4+的B 细胞主要位于上皮岛附近，与文献报道的亲上皮性相一致。

唾液腺MALT 淋巴瘤常在BLEL 的基础上发展而来，在疾病早期，肿瘤性淋巴细胞总是位于上皮岛内或紧邻上皮岛的周边， 提示发生恶性转化的B淋巴细胞与上皮关系密切。 我们的研究结果表明，唾液腺MALT 淋巴瘤中，94.44%的病例中存在FCRL4+的B 淋巴细胞，且均与上皮关系密切，在紧邻上皮的部位表达强度明显高于远离上皮的部位。另外，FCRL4 在唾液腺MALT 淋巴瘤中的表达明显高于唇腺BLEL 和大唾液腺BLEL， 这一结果与Haacke 等[6]的研究结果相一致。 在唇腺BLEL 中，FCRL4+B 淋巴细胞较少，散在于导管上皮细胞的周边， 而在大唾液腺BLEL 中，FCRL4+B 淋巴细胞有增多趋势， 这可能与唇腺BLEL 中常无增生上皮岛而大唾液腺BLEL 中增生上皮岛较明显有关。 当病变进一步发展为MALT 淋巴瘤后，FCRL4+B 淋巴细胞数目进一步增加， 提示FCRL4+B 淋巴细胞亚群可能参与了BLEL 中淋巴细胞的恶性转化。

本研究中， 我们同时检测了颌面部最常见的B细胞淋巴瘤DLBCL 中FCRL4 的表达，发现在10%的DLBCL 中存 在FCRL4 表 达。 Ikeda 等[14]报 道 在DLBCL 中，FCRL4 表达率可达33.7%， 且在非生发中心来源的DLBCL 中的表达明显高于生发中心来源的肿瘤，而MALT 淋巴瘤为来源于边缘区淋巴组织的B 细胞淋巴瘤， 与非生发中心来源的DLBCL是否在起源上有某种程度上的交叉还不得而知，其具体机制还有待于进一步研究。

我们首次统计了唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 蛋白表达与临床病理指标及预后之间的关系，结果显示FCRL4 的表达与临床病理指标、预后等之间无明显相关性， 提示FCRL4+B 淋巴细胞可能与唾液腺MALT 淋巴瘤的发生相关，但在病变进展中的作用还有待于进一步研究。 由于本研究只用免疫组织化学方法检测了FCRL4 的蛋白表达情况，利用更精准的技术如荧光定量PCR、转录组测序检测FCRL4 在不同组织中的表达将是我们进一步研究的方向。

综上所述， 我们的结果表明， 在唾液腺MALT淋巴瘤中，FCRL4 蛋白表达程度高于其前驱病变BLEL，且表达FCRL4 的肿瘤细胞与上皮岛相邻，提示FCRL4+ B 淋巴细胞可能参与了BLEL 的恶性转化，并且上皮细胞的趋化作用在其恶性转化中发生了作用。 而唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 表达明显高于颌面DLBCL，提示其在肿瘤的鉴别诊断中有一定价值。