重组醇脱氢酶基因工程菌的构建

焦学诗玛，周文煊，陈文欣，尹龙飞

（台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000）

0 引言

目前，全球心血管病发病率逐年上升，每年死于心血管疾病的人数不断增加。据世界卫生组织预测，到2030年，全球将有2300万人死于心血管疾病。据统计，2011年，全球心血管病药物市场规模超过1 000亿美元，市场规模仅次于抗肿瘤的治疗类药物，其中降血脂药物市场规模达370亿美元，占据心血管病药物市场规模的1/3［1］。他汀类药物，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，是目前应用最广泛、效果最理想的降脂药物。其中的明星药物立普妥（阿托伐他汀钙）更是创下了累计销售额达到约 1500亿美元的销售神话［2］。

他汀类药物除在母核上有较大修正，其侧链的化学结构基本保持不变，即（3R，5S）-二羟基酯结构，此侧链一般都是通过合成（4R-cis）-6-甲醛基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯（以下简称D7）形成。他汀类药物的母核的合成方法已经基本成熟，所以合成关键就在于侧链的构建，其中对侧链醛的碳链构建及两个手性中心建立的研究探索很多。国内外研究表明，目前构建手性碳中心的策略方法较多，主要可分为：手性辅助剂法［3-4］、手性池法［5］、不对称催化法、手性拆分法。但是这些路线使用剧毒物氰化钠和极易自燃且价格昂贵的二乙基甲氧基硼，存在高成本、高耗能、高排放的缺点。此外各国研究人员都在研究用生物催化的方法来替代化学合成过程中的某些关键步骤，从而降低排放且环境友好［6-9］。他汀侧链合成的最后一步目前采用CoCl2催化（4R-cis）-6-羟甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯（简称D6）合成D7方法，如图1所示，但是它存在利用化学法合成的各种缺点。

醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH，EC 1.1.1.1）是一种以NADH或NADPH为辅因子，催化醇和醛/酮之间双向可逆的氧化还原反应，催化反应以NAD（H）或NADP（H）为辅酶。当底物为还原态物质，辅酶是氧化态时，醇脱氢酶催化氧化反应为主；而相反条件下醇脱氢酶则催化还原反应为主，利用醇脱氢酶在催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应的研究报道较多［10-11］。特别是醇脱氢酶是作为氧化还原酶中一类重要的手性合成催化剂，醇脱氢酶由于立体选择性高、对底物的适应性较广已经在手性化合物的制备中得到广泛应用［12-14］。

图1 从D6到D7的化学催化合成

本研究将对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）醇脱氢酶基因进行克隆，并将其导入到大肠杆菌中，构建重组脱氢酶基因工程菌，为用生物催化法合成他汀类药物的手性侧链奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

S.cerevisiae、用于质粒的扩增与目的基因克隆的大肠杆菌DH5α（Escherichia coliDH5α）、用于目的基因的表达的大肠杆菌BL21（E.coliBL21）、表达载体的pET-28b（+）均为实验室保藏，质粒pMD18-T购买于宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 实验试剂

TaqDNA聚合酶、T4 DNA 连接酶、Nco I、Xho I、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marker，蛋白质Marker均购买于北京鼎国昌盛有限公司；氨苄青霉素、卡那青霉素、琼脂糖、核酸染料DNA green、酵母浸出粉、蛋白胨均购买于上海生物工程有限公司；胰蛋白胨、琼脂、酵母提取物均购买于Oxoid公司。

1.1.3 实验器材

A300 PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司），JY300电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），WD-9413C凝胶成像系统（北京六一仪器厂），VCX130PB/VX130超声破碎仪（美国Sonic公司），SX-500高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY公司）。

1.1.4 引物设计与合成

依据S.cerevisiae的醇脱氢酶基因序列（NM_001180183.1）使用primer premier设计引物，分别在引物5'端添加酶切位点以保护碱基，由上海生工合成。

UP5'GCCCATGGATGGGTTCTTTCCACCAGCAA 3'（Nco I）

DW 5'GACTCGAGAACTTTCTGCGCGGCGTAGTTG 3'（Xho I）

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

运用 Clustal W 软件对S.cerevisiaeS288C，S.cerevisiaeYJM1342，Zygosaccharomyces bailiiISA1307，Kluyveromyces marxianus的氨基酸序列进行对比。本研究涉及的基因序列与氨基酸序列，来自美国国立生物技术信息中心NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2.2 酿酒酵母脱氢酶目的基因的克隆与回收

（1）PCR反应体系为50µL，其中上下游引物各2µL（0.5µmol/L），基因组DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶 1µL，dNTP 4 µL，10×Buffer 5 µL，ddH2O 补足至 50 µL。

（2）反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸70 s，循环32次；72℃延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒根据说明书回收PCR扩增产物。

1.2.3 PCR产物与T载体的连接及转化

（1）总连接体系为 10 µL，其中 1.0 µL T4 DNA Ligase，1.5µL质粒 pMD18-T，1.0 µL T4 DNA Ligase Reaction Buffer，1.5 µL PCR 产物，5.0 µL ddH2O。

（2）16℃中连接10 h，在PCR仪里进行，连接产物的转化按照分子克隆操作［15］。

1.2.4 重组质粒pMD18-T-S288C的提取与酶切鉴定

挑选单菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养12 h，用质粒抽提试剂盒按照说明书提取重组质粒，利用限制性内切酶Nco I、Xho I进行双酶切，电泳检测酶切结果。

1.2.5 重组质粒pET-28b-S288C的连接及转化

（1）用限制性内切酶Nco I、Xho I对pET-28b载体进行酶切。

（2）用T4 DNA连接酶将pET-28b载体和质粒pMD18-T-S288C的酶切产物相连接，获得新的重组质粒pET-28b-S288C。

（3）连接产物转化入BL21，在LB液体培养基中，在37℃恒温下，200 rpm/min培养30 min；涂板于含卡那霉素的LB平板上，然后挑取单菌落37℃培养过夜，再抽质粒并酶切电泳鉴定。

1.2.6 重组质粒pET-28b-S288C的提取与酶切鉴定

挑选单菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养12 h，用质粒抽提试剂盒提取重组质粒，利用限制性内切酶Nco I、Xho I进行双酶切，电泳检测酶切结果。

1.2.7 SDS-PAGE鉴定

接1 ml新鲜菌液至50 ml LB液体培养基中，培养至OD=0.6-0.8，加0.5 mM IPTG在25℃下诱导16 h，取诱导后的菌液，4℃8000 rpm/min离心5 min收集菌体，用PBS缓冲液清洗2次，再用超声破碎仪破碎至菌液澄清，4℃13000 rpm/min离心10 min，取上清液和沉淀，加上样缓冲液于沸水浴中煮沸10 min，最后用SDS-PAGE鉴定。

2 结果与分析

2.1 脱氢酶氨基酸的多序列对比

运用 Clustal W 软件将S.cerevisiaeS288C与S.cerevisiaeYJM1342、Z.bailiiISA1307、K.marxianus进行多序列对比，发现S.cerevisiaeS288C的氨基酸序列与S.cerevisiaeYJM1342、Z.bailiiISA1307的氨基酸序列相似度较高，而与K.marxianus的氨基酸序列相似度较低，如图2所示。

图2 脱氢酶的氨基酸多序列对比

2.2 酿酒酵母脱氢酶基因的PCR扩增

以酿酒酵母基因组为模板进行PCR扩增，PCR结果如图3所示。图中扩增产物所对的DNA条带即为目的基因大小相对应，约939 bp。

2.3 重组质粒pMD18-T-S288C双酶切验证

如图4所示，重组质粒pMD18-T-S288C采用限制性内切酶Nco I、Xho I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker相对比，获得大小约939 bp和3000 bp两条带，分别对应目的基因和T载体的长度大小。重组质粒中的基因序列再以pMD18-T载体通用引物测序、对比，与目的基因序列一致。

图3 PCR扩增产物

图4 重组质粒pMD18-T-S288C电泳验证（M：Marker）

2.4 重组质粒pET-28b-S288C双酶切验证

将重组质粒pET-28b-S288C采用限制性内切酶Nco I、Xho I双酶切，所得产物经琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker相对比，获得大小约939 bp和5300 bp两条带，如图5所示，与基因和pET28b的大小一致，表明基因已成功连接到表达质粒pET28b上。

2.5 SDS-PAGE鉴定

菌株通过摇瓶诱导培养，再超声破碎后，进行SDS-PAGE分析。如图6所示，跟①号未加诱导剂的空白对照相比，②、③号条带分别是加IPTG诱导剂后离心得到的沉淀与上清，在35 KDa处上方有特异性蛋白质表达，与预测的目的蛋白的分子量35.56 KDa基本一致；可知目的蛋白主要在上清液中，为可溶性表达，没有发生变性，为后面应用该重组蛋白去实现生物催化反应奠定了基础。

图5 重组质粒pET-28b-S288C电泳验证（M:Marker）

图6 SDS-PAGE分析

3 结论

他汀类药物除了降低胆固醇以外，还具有免疫抑制性，被作为器官移植后排斥疗法的常规药物，因此在世界范围内他汀类药物需求量正在不断扩大［16］。然而化学合成他汀类药物手性侧链存在着高排放、高污染、高成本等问题，生物催化法因绿色无污染且成本低而被各国学者喜爱。本文通过PCR扩增目的基因，首先连接到pMD18-T载体，待目的基因序列测序验证正确后再连接到表达载体pET28b，最后成功构建了重组脱氢酶基因基因工程菌株BL21-pET28b-S288C，并实现了该基因在大肠杆菌中的高丰度可溶性表达。如何利用生物催化法将脱氢酶基因工程菌运用到他汀类药物关键侧链的合成以及工业生产中，今后仍需要进一步深入研究。