一种特异性识别半胱氨酸的荧光探针的合成及性能研究

陈彩霞，厉凯彬，韩得满

（台州学院 医药化工与材料工程学院，浙江 台州 318000）

0 引言

半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是哺乳动物体内的三大生物硫醇，它们在生物体内的生理和病理过程中发挥着至关重要的作用［1］。其中，Cys是一种含有巯基的还原性氨基酸，也是人体必需的氨基酸之一。它可以由人体内的蛋氨酸（甲硫氨酸，人体必需氨基酸）转化而来。Cys在蛋白质合成，解毒，金属结合，翻译后修饰和代谢等过程中发挥着重要的作用［2-3］。然而，生物体内硫醇浓度的异常可能会引发多种疾病，Cys的缺乏将会导致儿童生长缓慢、肝脏损伤、皮肤疾病等病症［4］；血浆中Hcy的浓度过高会诱发心血管疾病、阿尔兹海默病以及骨质疏松等疾病［5］；机体内GSH的浓度的异常会增加白血病、癌症以及艾滋病的发生率［6-7］。因此，迫切需要开发一种有效的方法来选择性地检测Cys、Hcy和GSH。

用于检测巯基物质的方法有很多，包括电化学法、高效液相色谱法（HPLC）以及毛细管电泳法（CE）等［8-9］。相比于这些，荧光探针具有结构多样性、合成成本低、较好的细胞膜渗透性、生物安全性、功能可设计性等优点，已成为快速灵敏检测样品的有效方法［10-12］。最近，已开发出大量用于生物硫醇的荧光探针，相应的设计策略通常基于硫醇基团的强亲核性以及各种反应机理，如迈克尔加成，环化，裂解反应等［13-15］。但由于相似的结构和反应性，大多数报道的文献难以区分这三种巯基氨基酸（Cys/Hcy/GSH）［16-19］。

因此，开发用于区分Cys/Hcy/GSH的选择性荧光探针是非常具有挑战性的。本文报道了一种能特异性识别Cys的荧光探针。该探针是将N-羟乙基-4溴-1，8-萘酰亚胺与SBD-Cl通过哌嗪相连制备而成的，制备方法简单，操作容易，稳定性较好，对Cys响应时间较短，紫外和荧光光谱上都能表现出其独特的变化。

1 实验部分

1.1 实验试剂和仪器

实验中所购买的化学试剂均为分析级。相关的化学反应都在氮气的保护下进行，并不定时地使用硅胶预涂的E-Merck铝板通过TLC监测反应。所有的试验用水均为去离子水。此外，使用四甲基硅烷（TMS）作为内标在Bruker AM-400光谱仪上记录1H和13C NMR光谱。使用标准条件（ESI，70eV）在Waters LCT Premier XE光谱仪上记录高分辨率质谱。使用梅特勒托利多FE28型pH计缓冲溶液pH值的测定。使用安捷伦Cary 60 UV-Vis分光光谱仪进行紫外-可见光谱的测定。使用Varian Cary Eclipse荧光光谱仪进行荧光光谱的测定。

1.2 化合物1的合成

图1 化合物1（探针）的合成路线

第一步：在氮气的保护下，准确称取N-羟乙基-4溴-1，8-萘酰亚胺（2.0 g，6.26 mmol），哌嗪（697 mg，8.10 mmol）置于50 mL圆底烧瓶中，加入20 mL乙二醇单甲醚溶解，在100℃的条件下回流搅拌反应10小时。TLC检测反应完全，停止反应，待混合物冷却至室温，抽滤，所得固体先用少量乙二醇单甲醚溶液洗涤，再用石油醚冲洗，最后放入真空干燥箱内干燥，产物为化合物3，直接用于第二步反应。

第二步：在氮气的保护下，称取第一步产物3（200 mg，0.62 mmol）置于50 mL圆底烧瓶中，加入20 mL二氯甲烷溶解，向上述溶液中滴加208µL三乙胺，再用2 mL二氯甲烷溶解SBD-Cl（126 mg，0.50 mmol），并滴加到上述混合液中，25℃搅拌反应1小时。利用薄层色谱检测反应完全后停止反应，旋转蒸发除去溶剂，并用柱层析（流动相比例：甲醇/二氯甲烷=1/20）分离提纯得到最终产物1 124 mg，产率为98.4%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 8.44（d，J=8.0 Hz，1 H），8.39（d，J=8.0 Hz，1 H），8.32（d，J=8.0 Hz，1 H），8.11（d，J=8.0 Hz，1 H），7.99（d，J=8.0 Hz，1 H），7.75（t，J=8.0 Hz，1 H），7.35（d，J=8.0 Hz，1 H），4.79（t，J=2.0 Hz，1 H），4.12（t，J=8.0 Hz，2 H），3.57（q，2 H），3.53（m，4 H），3.30（m，4 H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ 164.1，163.6，155.2，149.7，146.7，136.8，133.2，132.4，131.2，131.1，129.5，126.7，126.6，125.8，124.7，123.2，117.0，116.2，58.3，52.5，46.1，42.1;HR-ESI-MS m/z:［M+Na］+calcd.for 564.0721 found 564.0714。

1.3 光谱测试

1.3.1 标准溶液和PBS缓冲溶液的配制

准确称量化合物1（1.0 mg）溶于1.845 mL DMSO中，得［M］=1×10-3mol/L的探针标准溶液。利用Na2HPO4、NaH2PO4配制pH=7.4的磷酸缓冲溶液备用。

1.3.2 随时间变化紫外吸收光谱曲线的测定

准确移取20µL探针1标准溶液，加入到1 mL PBS缓冲溶液和1 mL DMF溶液混合体系中，向其中分别加入50µM Cys，Hcy和GSH，分别测定紫外吸收光谱曲线随时间的变化。

1.3.3 随时间变化荧光光谱曲线的测定

准确移取20µL探针1标准溶液加入1 mL PBS缓冲溶液和1 mL DMF溶液混合体系中，向其中各加入0-50µM Cys，测定并观察荧光光谱曲线随着Cys浓度的变化，激发波长为400 nm。

1.3.4 探针1在不同pH下对Cys的响应测试

准确移取20µL探针1标准溶液加入1 mL HCl-Tris缓冲溶液（pH=2-12）和1 mL DMF溶液混合体系中，向其中各加入50µM Cys，测定并观察探针1在不同pH下对Cys的响应效果。

1.3.5 选择性的测定

分别准确移取20µL探针1标准溶液加入1 mL PBS缓冲溶液和1 mL DMF溶液中，分别向其中加入50 µM的Cys、GSH、Hcy、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、色氨酸（Trp）、苏氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、组氨酸（His）、甲硫氨酸（Met），放置 20 min 后分别测定在不同干扰物存在下荧光发射光谱曲线变化。

2 结果与讨论

2.1 探针1的合成表征

如图1所示，探针1是N-羟乙基-4溴-1，8-萘酰亚胺与SBD-Cl通过哌嗪相连制备而成的，合成简便，便于放大合成，其化学结构和1H NMR，13C NMR，HR-MS分析结果一致。（详细数据见1.2）

2.2 探针的光谱性能测试

为了研究探针的应用价值，以2 mL PBS-DMF（v/v=1:1，pH=7.4）混合溶液为测试体系，研究了探针对Cys的检测性能。如图2所示，当加入过量的Cys后，335 nm处的吸收峰消失，同时400 nm处的吸收峰增强，之后400 nm处的吸收峰红移至410 nm，这表明探针1与Cys的反应过程分两步进行。当加入过量的Hcy/GSH后，只发生335 nm处吸收峰消失和400 nm处吸收峰增强，未出现光谱红移的现象，说明探针1与Hcy/GSH反应只有一步反应。

如图3（a）所示为探针在不同浓度Cys（0-50µM）存在下的荧光光谱图，荧光强度随着Cys浓度的增加而增强，且荧光发射峰由530 nm红移至570 nm。而当加入Hcy/GSH 30 min，530 nm处荧光强度小幅度增强，但并没有发生红移的现象，如图3（b）所示。pH往往是影响探针传感性能重要条件，因此，我们探究了不同pH条件下探针1对Cys的响应情况，如图3（c）所示。探针1在pH=2-12的范围内具有很好的稳定性，且在pH=7-12范围内对Cys较佳的响应效果。这表明探针1可用于在生理环境的pH范围下对Cys的检测。

另外，研究了探针1对Cys的选择性，如图3（d）所示。探针1对Cys具有很好的荧光响应，能对Hcy/GSH产生一定的荧光响应，但其不能使光谱发生红移现象。另外，探针1对其他不含巯基氨基酸（Ala、Arg、Gly、Trp、Thr、Phe、Leu、Ser、Pro、His、Met）不产生荧光响应。上述实验结果表明，探针1对Cys具有优良的选择性。

图2 探针1在不同氨基酸下的紫外光谱曲线变化图

图3 探针1对氨基酸响应的荧光光谱数据图

因此，根据以上紫外荧光光谱性能数据及文献［11］和［13］中报道的有关硫醇响应探针的反应机理，我们推测探针1响应硫醇的反应机理如图4所示。探针1与Cys发生两步反应，Cys分子内的巯基先取代探针分子中的氯原子，随后发生一步分子内重排反应，氨基进一步取代硫原子；由于Hcy/GSH分子内的氨基距离巯基较远，无法发生重排反应。

图4 探针1与Cys和Hcy/GSH的反应机制

3 结论

本文通过两步常规反应，将N-羟乙基-4溴-1，8-萘酰亚胺与SBD-Cl通过哌嗪相连制备得到一种能够用于选择性检测Cys的荧光探针化合物，其化学结构与1H NMR、13C NMR、HR-MS分析结果一致。该探针合成方法简单，光谱性能稳定性较好，可以快速、灵敏地与Cys响应，紫外光谱曲线发生比率型变化，荧光光谱曲线增强同时伴有30 nm的红移。该研究结果为发展新型硫醇类荧光探针提供了思路。