miR-210通过激活IL-6/STAT3炎性信号通路促进复发反流性食管炎患者的恶性发展

王万里，马 幸

郑州市第七人民医院消化内科，河南 郑州 450000

近年来，随着人们生活和饮食习惯的大幅改变，反流性食管炎的发病率在我国呈逐年上升趋势，严重影响人们生活质量[1-2]。相关研究报道，药物刺激、环境恶化及遗传差异等多种因素均可导致食管刺激、出血性食管炎、食管狭窄的形成和慢性食管炎的发展，及早预防及诊疗此病能够有效改善患者病情并对其进行有针对性的治疗[3-5]。然而，临床上除组织病理检查外，仍缺乏有效的早期诊断指标。miRNA是一组高度保守的非编码小RNA，能够促进mRNA降解或抑制转录后翻译[6-8]。越来越多的证据表明，miRNA参与机体多种疾病的发生、发展[9-10]。近年来，miR-210已被广泛研究，并明确其能够参与调控机体线粒体代谢、血管生成、DNA损伤反应、细胞增殖和凋亡等进程[11-14]。本研究主要探究复发反流性食管炎患者血清及食管组织中miR-210的表达及其对下游IL-6/STAT3炎性信号通路的影响，阐明miR-210是否通过激活下游IL-6/STAT3炎性信号通路进而促进疾病的恶性发展和不良预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年8月至2017年5月我院消化内科收治的95例复发反流性食管炎患者作为观察组，男49例，女46例。选取同期于我院体检中心进行体检的95名健康志愿者为对照组，男50名，女45名。所有观察组患者接受内镜切除食管组织前均未接受任何形式的放化疗或生物治疗。患者纳入标准为经我院病理科通过组织病理活检和CT扫描确诊为复发反流性食管炎且自愿参与本研究患者；排除标准为：(1)伴有心脑血管疾病、内分泌疾病及其他重要脏器功能障碍患者；(2)正在服用其他并发症等治疗性药物患者。所有患者均具备完整的病历资料，并于术前签署知情同意书，且本研究通过医院伦理委员会批准。两组受试者性别、年龄、BMI及既往疾病等一般临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 观察指标及其检测方法

1.2.1 HE染色观察组织病理变化：将上述组织病理样本保存于4%多聚甲醛溶液(Sigma生物公司，P6148)备用，采用浓度梯度乙醇溶液和二甲苯脱水处理后进行石蜡包埋，采用二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后进行HE染色，中性树胶封固，光学显微镜下观察食管组织病变变化。

1.2.2 血清指标：研究前收集所有受试者空腹静脉血约4 ml，至入抗凝管中4 ℃低温静止1 h，常温条件下12 000 r/min离心20 min，取上清液保存于-80 ℃备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(Elabscience生物公司)观察两组受试者血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达差异。所有实验操作严格按照说明书进行，反应结束后于ELISA检测仪检测各孔吸光值(OD)，采用空白对照孔调零，本研究中>阴性对照OD值的2.1倍结果即为阳性。

1.2.3 组织生物学指标：所有受试者食管病变部位组织活检由我院病理科医护人员收集后于-80 ℃冻存备用。分别采用反转录-聚合酶链反应法(qRT-PCR)(Takara生物公司)和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测(碧云天生物公司)受试者食管组织内miR-210及其下游IL-6/STAT3炎性信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平，对比分析两组受试者上述指标的表达差异。

2 结果

2.1 食管组织病理检测结果观察组和对照组食管组织病理检测结果见图1。对照组食管组织上皮细胞均匀分布，细胞核大小正常，且细胞有正常极向。观察组患者食管组织基底层增厚，细胞融合且胞核异常变大，细胞极向消失，提示观察组食管组织炎性病理损伤较对照组明显加重。

图1 HE染色法观察受试者食管组织病理变化 A、C：对照组；B、D：观察组Fig 1 Pathological changes in esophageal tissues of the subjects detected by HE staining A, C： control group; B, D: observation group

2 2 血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达结果观察组和对照组血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平检测结果如表1所示。观察组患者血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平与对照组相比均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达Tab 1 Expressions of miR-210 and inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α in serum

2.3 食管组织中miR-210及IL-6/STAT3炎性信号分子mRNA表达结果观察组和对照组食管组织中miR-210及IL-6/STAT3炎性信号分子mRNA表达结果如图2所示。观察组患者病变食管组织内miR-210及其下游IL-6/STAT3炎性信号通路相关分子的mRNA表达水平较对照组显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 食管组织中IL-6/STAT3炎性信号分子蛋白表达结果观察组和对照组食管组织中IL-6/STAT3炎性信号分子蛋白表达结果如图3所示。观察组患者食管组织内IL-6和p-STAT3的蛋白表达水平较对照组显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001。图2 食管组织中miR-210及IL-6/STAT3炎性信号分子mRNA 的表达Fig 2 Expressions of miR-210 and IL-6/STAT3 inflammatory signal molecules mRNAs in esophageal tissues

注：与对照组比较，**P<0.05。图3 Western blotting检测受试者食管组织中IL-6/STAT3炎性信号分子蛋白表达 A：免疫印迹目的蛋白；B：统计分析图Fig 3 The expressions of IL-6/STAT3 inflammatory signal molecule proteins in esophageal tissues detected by Western blotting A: immunoblotting target protein; B: statistical analysis chart

2.5 Pearson相关性分析血清miR-210与患者临床病理分级和预后相关性Pearson相关性分析结果如表2所示。观察组患者血清中miR-210的表达水平与患者的临床病理分级呈正相关(r=0.926，P=0.012)，而与患者预后呈负相关(r=-0.935，P=0.010)。

表2 Pearson相关性分析血清miR-210与患者临床病理分级和预后相关性

Tab 2 Correlation of serum miR-210 with clinicopathological grade and prognosis by Pearson correlation analysis

指标r值OR值95% CIP值临床病理分级0.9261.2431.131～1.8260.012患者预后-0.9351.3291.127～1.9720.010

3 讨论

近年来，越来越多的证据表明，miR-210参与了人体多种生物学过程[15]。miR-210是多种细胞功能的调节因子。其中，神经发生是一个多步骤的复杂过程，在脑损伤中，神经发生的特征是内源性神经干细胞(NSCs)的大量增殖和迁移，这种增殖和迁移在损伤后数日达到高峰，随后是一段较长的分化、存活和整合期。最近的研究表明miR-210在体内能够促进缺血缺氧后神经病变发生[16-18]。近期关于miR-210表达抑制导致NSCs增殖率下降的机制及其伴随的代谢变化取得一定进展[19]。miR-210在调节线粒体代谢中发挥作用。然而，研究也发现，miR-210抑制能够促进NSCs培养中线粒体氧化代谢[20]。因此，miRNA表达异常影响细胞功能的多个方面，从增殖、分化到凋亡，均与miRNA的变化和病理有关。

JAK-STAT3通路是IL-6、IL-1β和TNF-α等多种细胞因子的下游信号通路，在多种炎症相关性疾病中发现该通路也持续高度活化，且与炎性疾病的发生、发展密切相关[21-23]。IL-6是一种促进炎症发生及炎、癌转化的细胞因子，其作为检测恶性肿瘤的生物标志物，灵敏度和特异度分别为84%～90%和87%～92%[24-25]。IL-6可通过与其受体结合，活化STAT3信号通路，激活一系列下游蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖[26-27]。STAT3属于信号传导和转录激活因子家族，在正常细胞的胞浆中保持非激活状态，当STAT3通过G蛋白偶联受体、Toll样受体、IL-6受体等通路被激活，它通过JAK/STAT3通路促进靶基因转录，也可以作为MAPK的底物传递Ras-MAPK通路的信号在胃癌中，持续性的STAT3激活不仅会使基因转录失调，造成癌基因及癌相关基因表达，从而促进细胞增殖、血管生成和肿瘤转移，而且还影响细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答[28-29]。

本研究通过对我院收治的95例复发反流性食管炎患者进行研究，结果显示观察组患者血清中miR-210及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平较对照组相比均显著上调，差异有统计学意义。观察组患者食管组织内miR-210及其下游IL-6/STAT3炎性信号通路相关分子的mRNA和蛋白表达水平较对照组相比均显著上调。HE染色结果显示，观察组食管组织炎性病理损伤较对照组明显加重。此外，Pearson相关性分析结果表明，观察组患者血清中miR-210的表达水平与患者的临床病理分级呈正相关，而与患者预后呈负相关，上述研究结果表明，miR-210与复发反流性食管炎密切相关，其异常表达可通过激活IL-6/STAT3炎性信号通路促进患者的恶性发展。

综上所述，miR-210异常表达介导的IL-6/STAT3炎性信号通路活化与复发反流性食管炎的发生、发展密切相关，靶向miR-210有望成为临床复发反流性食管炎患者的治疗新路径，同时可考虑将血清miR-210作为上述患者早期诊断指标。