ST8SIA6-AS1与hnRNPA2B1相互作用通过激活AKT活性并下调P21促进肝癌进展

吴 桐，马明镜，邓明德

陆军军医大学第二附属医院，重庆 400037

肝癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，是全球范围内与肿瘤相关的死亡的主要原因[1-2]。肝癌占所有新诊断癌症病例的80%，约55%的肝癌患者居住在中国[3]。虽然肝切除术取得了很大进步，肝移植和肝癌的综合治疗也取得了进展，但该疾病的5年总生存率仍然不尽人意[4]。因此，迫切需要鉴定新的预后分子生物标志物并进一步了解肝癌发生、发展的潜在分子机制，以开发针对该疾病的新治疗策略。

长链非编码RNA(lncRNA)是指长度>200个核苷酸的RNA分子，无或只有很小的蛋白质编码能力[5]。最近的数据反复证明了lncRNA在各种生物过程中的关键作用，如免疫调节、分化和凋亡[6-7]。lncRNA可以通过顺式或反式调节发挥功能[8]。此外，lncRNA还可以与蛋白质或mRNA分子相互作用，从而影响其稳定性[9-10]。重要的是，lncRNA在肿瘤发生中也扮演着非常重要的角色。例如，HNF1A-AS1通过与SHP1直接相互作用抑制肝癌细胞的恶性表型，并发挥磷酸酶激活剂的作用[11]。相反，HOXA11-AS作为竞争性内源RNA(ceRNA)通过相应miR-214-3p促进肝细胞癌的发展[12]。本研究中，我们鉴定了一个在肝癌中发挥重要作用的新型lncRNA:ST8SIA6-AS1。目前报道ST8SIA6-AS1在乳腺癌中与KLHDC7B高度相关，但两者在增殖、周期等中发挥相反的作用[13]，在人类乳腺癌、肺癌和胰腺癌中，敲低ST8SIA6-AS1导致有丝分裂紊乱和大量细胞凋亡[14]。由此可见，ST8SIA6-AS1在癌症发生发展中有着非常重要的作用，但ST8SIA6-AS1在肝癌中的作用却未见报道，因此，我们主要筛选了在肝癌中高表达且具有显著临床预后特征的ST8SIA6-AS1，并研究其在肝癌中的功能及分子机制，以期为临床上肝癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床数据筛选在临床数据库GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[15]中，通过tumor/normal>2找到在肝癌中差异表达的基因，从而筛选出在肝癌中最高表达的3个lncRNA，同时研究它们在各肿瘤中的表达情况及对于肝癌预后的影响，结合经典的分子生物学实验进一步研究其在肝癌中的作用。

1.2 细胞培养人肝癌细胞HepG2购自美国ATCC细胞库，培养在含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基(购自BI代理公司)中，并加入100 μg/ml链霉素和100 IU/ml青霉素。细胞培养瓶置于体积分数为5%的CO2和95%湿度的37 ℃培养箱中。

1.3 转染以6孔板转染siRNA为例：将1 μl siRNA(购自广州锐博公司)与250 μl Opti-MEM(thermo：11058021)混匀，1 μl lipo2000(invitrogen：11668027)与250 μl Opti-MEM混匀，室温放置5 min，然后将两部分合并，混匀，静置15 min，之后逐滴、均匀加入6孔板中的1个孔中。

1.4 细胞增殖实验消化长满的10 cm盘细胞，重悬于1 ml新鲜培养基中，用20 μl可铺1个96孔板的密度铺细胞，每个实验组需3个生物重复，铺好所需的实验孔数。在体积分数为5% CO2，37 ℃条件下孵育。细胞贴壁后即可转染siCTL、siRNA#1、siRNA#2。48 h后开始测量吸光度。配制MTS(abcam：ab197010)反应液，按照MTS∶培养液=1∶20的比例配制反应液。每孔加入100 μl MTS反应溶液，37 ℃继续培养。每隔半小时检测一次吸光度。将培养皿置摇床上低速振荡10 s以充分溶解结晶物。在490 nm处测量各孔的吸光值。将每天的吸光值转换成代表每日细胞生长的参数，并绘制细胞增殖曲线。

1.5 相互作用蛋白探讨通过NPInter[16]数据库找到可能与ST8SIA6-AS1相互作用的蛋白，进一步通过各蛋白的作用筛选到相互作用的蛋白。

1.6 RNA免疫沉淀实验目的DNA区域被扩增，进行体外转录以产生用于生物素标记的RNA。生物素标记的RNA被链霉亲和素磁珠捕获，与核内分离提取物孵育以形成RNA与蛋白质的相互作用，并洗脱结合RNA的蛋白质，并进行蛋白质印迹实验进行RNA与蛋白质相互作用的进一步鉴定。

1.7 蛋白质免疫印迹实验收集细胞进行蛋白定量并制样，准备电泳、电转装置，电泳液及电转液，将样品加入凝胶中，100 V进行电泳，待蓝色条带跑出即进行电转，100 V电转2 h，将蛋白膜放在牛奶中封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜4次，每次5 min，室温孵育二抗1 h，洗膜4次，每次5 min，暗房显影。

2 结果

2.1 筛选肝癌中具有临床意义的lncRNA为了找到在肝癌发生发展中具有重要作用的lncRNA，我们首先在临床数据库GEPIA中筛选了相对于正常肝组织，在肝癌中存在差异表达的lncRNA，共找到55个存在差异的lncRNA(见图1A)，其中包括在肝癌中低表达的35个lncRNA和20个高表达的lncRNA(见图1B)，在这20个高表达的lncRNA中，尤其以MIR4435-2HG、HULC和ST8SIA6-AS1表达差异最明显(见图1C)。

2.2 细胞增殖实验筛选目标lncRNA为了在表达差异最明显的MIR4435-2HG、HULC和ST8SIA6-AS1三个lncRNA中进一步筛选到影响肝癌细胞生长更显著的lncRNA，我们通过两条不同的siRNA介导敲低MIR4435-2HG、HULC和ST8SIA6-AS1的表达，同时转染siCTL作为对照，进行了细胞增殖实验，筛选结果显示，相比于MIR4435-2HG和HULC，在敲低ST8SIA6-AS1的表达后，细胞生长被显著抑制(见图2A)，同时box plot图表进一步验证了此结论(见图2B)。

图1 筛选肝癌中具有临床意义的lncRNA A：肝癌中差异性表达基因分类；B：肝癌中差异性表达的lncRNA；C：热图分析肝癌中 高表达的lncRNA在肝癌及其邻近正常组织中的表达情况Fig 1 Screening of clinically significant lncRNA in liver cancer A: classification of differentially expressed genes in liver cancer; B: differentially expressed lncRNA in liver cancer; C: heat map analysis of the expression of highly expressed lncRNA in liver cancer and adjacent normal tissues

图2 细胞增殖实验筛选目标lncRNA A：在肝癌细胞中分别敲低MIR4435-2HG、HULC和ST8SIA6-AS1表达后的细胞增殖速率；B：在肝癌细胞中分别敲低MIR4435-2HG、HULC和ST8SIA6-AS1表达后的细胞增殖速率统计图

Fig 2 Cell proliferation experiment screening target lncRNA A: cell proliferation rate after knocking down MIR4435-2HG, HULC and ST8SIA6-AS1 expressions in liver cancer cells; B: statistics of cell proliferation rate after knocking down the expressions of MIR4435-2HG, HULC and ST8SIA6-AS1 in liver cancer cells respectively

2.3 ST8SIA6-AS1在肿瘤中的表达特性及预后重要性由细胞增殖实验筛选结果进一步明确ST8SIA6-AS1在肝癌中的重要性，因此我们研究了ST8SIA6-AS1在各肿瘤中及肝癌中的表达特性及与肝癌的预后相关性，发现ST8SIA6-AS1只在肝癌和前列腺癌中具有显著表达差异性(见图3A)，且在肝癌中差异明显(见图3B)，进一步的预后结果发现，ST8SIA6-AS1的高表达显示预后差(见图3C)，由此进一步说明了ST8SIA6-AS1在肝癌发生发展中具有重要作用。

图3 ST8SIA6-AS1在肝癌中的表达特性及预后相关性 A：GEPIA数据库中显示ST8SIA6-AS1在各肿瘤中的表达情况；B：GEPIA数据库显示ST8SIA6-AS1在肝癌及肝正常组织中的表达情况；C：GEPIA数据库显示ST8SIA6-AS1与肝癌临床预后的相关性

Fig 3 ST8SIA6-AS1 expression characteristics and prognostic correlation in liver cancer A: the expression of ST8SIA6-AS1 in tumors in GEPIA; B: the expression of ST8SIA6-AS1 in liver cancer and normal tissue in GEPIA; C: the correlation between ST8SIA6-AS1 and clinical prognosis in liver cancer in GEPIA

2.4 ST8SIA6-AS1在肝癌中的分子机制探讨验证了ST8SIA6-AS1具有促进肝癌细胞生长增殖的重要作用，接下来我们探究了ST8SIA6-AS1在肝癌中发挥重要作用的分子机制，通过NPInter数据库我们预测到可能与ST8SIA6-AS1相互作用的蛋白(见表1)，发现hnRNPA2B1最明显且通过查阅文献发现其在肝癌中也具有重要作用，进一步通过查阅数据库发现hnRNPA2B1在肝癌中具有明显的高表达预后差的现象(见图4)，为了验证hnRNPA2B1与ST8SIA6-AS1可以相互作用的猜想，我们进行了ST8SIA6-AS1 RNA免疫沉淀实验，发现以hnRNP U为阴性对照，ST8SIA6-AS1确实可以与hnRNPA2B1相互作用(见图5)，通过查阅文献发现，hnRNPA2B1可以通过降解cleaved caspase-3和P21参与PI3K/AKT信号通路，因此我们通过siRNA介导敲低hnRNPA2B1的表达，发现敲低组cleaved caspase-3和P21的表达确实被上调，AKT的磷酸化水平被下调(见图6A、6C)，说明hnRNPA2B1在肝癌中通过参与PI3K/AKT信号通路影响肝癌进展，而ST8SIA6-AS1与hnRNPA2B1相互作用，暗示了ST8SIA6-AS1会通过PI3K/AKT信号通路促进肝癌细胞的进展，因此我们在siRNA介导下敲低ST8SIA6-AS1的表达，发现敲低组cleaved caspase-3和P21的表达确实被上调，AKT的磷酸化水平被下调(见图6B、6D)，由此说明了ST8SIA6-AS1通过降低cleaved caspase-3和P21这些细胞抑制子的表达激活PI3K/AKT信号通路，从而促进肝癌细胞生长增殖。

表1 NPInter数据库显示与ST8SIA6-AS1可能相互作用的 蛋白预测结果Tab 1 The proteins that may interact with ST8SIA6-AS1 in NPInter

续表1

Interact WithInteraction DescriptionUCHL5eCLIP experiment on K562 against UCHL5YBOX3eCLIP experiment on K562 against YBX3ZNF622eCLIP experiment on K562 against ZNF622MOV10derived from CLIP-seq datasetFBLderived from CLIP-seq datasetHNRNPA1derived from CLIP-seq datasetU2AF2derived from CLIP-seq dataset

图4 GEPIA数据库显示hnRNPA2B1与肝癌的临床预后 相关性Fig 4 The correlation between hnRNPA2B1 and clinical prognosis of liver cancer in GEPIA

图5 RNA免疫沉淀检测ST8SIA6-AS1与hnRNPA2B1相互作用

Fig 5 RNA immunoprecipitation to detect the interaction between ST8SIA6-AS1 and hnRNPA2B1

3 讨论

lncRNA参与了许多至关重要的生物学过程，包括致癌作用[17]。lncRNA可以通过与RNA、DNA或蛋白质相互作用来发挥其作用[18]。例如，TSLNC8在肝癌中通常被丢失，而TSLNC8与转酮醇酶(TKT)/信号转导子和转录激活因子3(STAT3)物理相互作用以调节STAT3[19]。lncRNA lncSox4可通过补体与Sox-4启动子相互作用，将STAT3募集到Sox-4启动子并诱导Sox-4表达[20]。lncRNA TNRC6C-AS1可与miR-129-5p/UNC-5 netrin受体B(UNC5B)形成复合物并可以作为竞争性内源RNA来促进甲状腺癌的进展[21]。同时，TNRC6C-AS1可以作为长链非编码反义RNA靶向TNRC6C来促进甲状腺乳头状癌的侵袭[22]。

图6 ST8SIA6-AS1与hnRNPA2B1相互作用降低cleaved caspase-3和P21的表达激活PI3K/AKT信号通路 A：敲低hnRNPA2B1 表达对PI3K/AKT信号通路关键基因的影响；B：敲低ST8SIA6-AS1表达对PI3K/AKT信号通路关键基因的影响； C～D：对图A～B的灰度统计

Fig 6 ST8SIA6-AS1 interacted with hnRNPA2B1 to reduce the expression of cleaved caspase-3 and P21 to activate the PI3K/AKT signaling pathway A: the effect of knocking down hnRNPA2B1 expression on key genes in PI3K/AKT signaling pathway; B: effect of knocking down ST8SIA6-AS1 expression on key genes of PI3K/AKT signaling pathway； C-D： gray statistics of figure A and B

理想的癌症治疗策略是选择性靶向癌细胞生存所必需的基因。癌细胞依赖于异常表达的癌基因来持续生长和维持其恶性表型，称为癌基因成瘾[23]。最近，功能丧失筛查已经确定了许多使癌细胞成瘾的蛋白质编码致癌基因。通常，此类重要基因在癌细胞中相对于相应的正常组织细胞中过表达，使其成为潜在的癌症治疗靶点[24]。lncRNA是一大类非蛋白质编码转录本，在肿瘤发生中起重要作用[25]。但目前关于lncRNA对癌细胞的存活至关重要的报道还较少。因此在本文中，我们通过在GEPIA数据库筛选使肝癌细胞成瘾的lncRNA，并进一步分析得到使肝癌细胞显著成瘾的3个lncRNA，最后通过细胞增殖实验我们筛选到使肝癌细胞最显著成瘾的lncRNA ST8SIA6-AS1，接着我们发现ST8SIA6-AS1在肝癌中具有明显的高表达预后差的临床意义，确定了其表达与肝癌临床结果高度相关，最后通过相互作用蛋白hnRNPA2B1发现敲低hnRNPA2B1和ST8SIA6-AS1均上调cleaved caspase-3和P21的表达并下调AKT的磷酸化水平，从而调节PI3K/AKT信号通路促进肝癌细胞生长增殖的分子机制，说明ST8SIA6-AS1有成为临床上治疗肝癌的潜在治疗靶标的可能性。

本文从数据库筛选显著差异表达基因结合细胞增殖实验确定目的基因，探讨目的基因在肝癌中的重要性，以及目的基因发挥功能的作用机制等方面研究了ST8SIA6-AS1在肝癌中的重要作用。但功能验证和机制探讨还不是很全面，需要更多的细胞周期及迁移侵袭等功能实验的验证和相互作用蛋白hnRNPA2B1在肝癌中的功能验证及hnRNPA2B1与ST8SIA6-AS1相互作用的进一步验证，使得结论更全面且更具有说服力。

综上，ST8SIA6-AS1可能作为肝癌的潜在药物治疗靶点，但其具体功能验证和作用机制仍需进一步深入研究。