GNA13在多种恶性肿瘤中的研究进展

朱伟力 马继伟， 周赫 邓畅 奚悦 夏明 赵苗青，★

近年来，随着分子诊断技术在临床中的广泛应用，其对于肿瘤的早期诊断以及预后治疗有着极其重要的临床意义。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）是己知的体内最大的蛋白质超家族，而G12亚家族中的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基13（Guanine nucleotide binding protein alpha 13，GNA13）被认为与癌基因转化和肿瘤细胞生长密切相关。有学者发现GNA13在人类的许多恶性肿瘤中表达上调，特别是在侵袭性强的乳腺癌和前列腺癌中；而且，GNA13的上调会促进这些恶性肿瘤细胞的侵袭和转移[1]。因此，本文以GNA13在肿瘤细胞中的信号转导机制为思路，总结其在恶性肿瘤中的作用机制及生物学特性。

1 G蛋白及G蛋白偶联受体的结构及其功能

G蛋白是一类信号转导蛋白，又称为GTP结合蛋白，种类大约有40余种，可将外界信号传递至细胞内，进而激活下游的各种信号通路[1]。GPCRs是一大类膜蛋白受体的简称，又称为七次跨膜受体[2]。GPCRs 被配体激活以后，通过G蛋白将细胞信号传导至下游效应子，进而调控细胞的生长代谢和改变细胞骨架结构等活动[3]。被激动剂（激素、神经递质和生长因子等）激活后的GPCRs 可以充当鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEF），进而催化GDP 交换Gα 亚基上的GTP。与GTP结合后，Gα与Gβγ分离的同时激活下游效应子，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶C和Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factors for Rho，RhoGEFs）等，进而开启不同的信号转导通路[3]。Gα（12/13）家族通路通过含有G蛋白信号调节因子同源结构域的Rho-GEFs 将信号传递给Rho 蛋白，从而调节细胞生长、基因转录和细胞骨架肌动蛋白的重排等[4]（见图1）。

2 GNA13的发现及功能研究

1991年Strathmann和Simon 在克隆小鼠中发现了G12亚家族中的Gα12和Gα13，它们的分子量约为44kDa。Gα12和Gα13 分别是由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α 亚基12（Guanine nucleotide binding protein alpha 12，GNA12）和GNA13 编码[5]。在人类中，GNA12 位于7号染色体上，GNA13 位于17号染色体上。GNA12 与GNA13 几乎在所有组织中都有表达，但是它们的表达都是十分保守的，并参与多种生理和发育过程[12]。研究表明，血管紧张素II，血栓烷A2，1-磷酸鸟苷-磷酸和溶血磷脂酸等都可以与GNA12/GNA13 耦联。同时，GNA12和GNA13组成的G12亚家族增强了与细胞分裂、增殖、迁移侵袭和肿瘤发生等许多病理生理活动[6]。

目前已经发现了很多与GNA12/GNA13 直接或间接相互作用的蛋白，其中包括RhoGEFs 蛋白家族所介导的信号转导通路，其调控着细胞增殖分化及肿瘤性转化[7]。由于该蛋白家族存在G蛋白信号调节因子结构域，因此GNA12和GNA13 可以通过该结构域与RhoGEFs 结合，将其从细胞质募集到胞膜上，并激活RhoGEFs，从而发挥鸟嘌呤交换因子的功能，以此来促使GTP 与RhoA 结合，进而引起细胞的形态改变以及收缩和迁移[8]。现已从Rho-GEFs 亚家族中鉴定出3种蛋白，包括p115-Rho-GEFs、PDZ-RhoGEFs和白血病相关的RhoGEFs（Leukaemia Associated RhoGEFs，LARG）[9]。研究表明，GNA13（非GNA12）可以直接刺激LARG和p115-RhoGEFs 的GEF 活性[10]。在体外的实验发现，GNA13 能够激活p115-RhoGEFs 或非磷酸化的LARG，而GNA12 通常激活酪氨酸磷酸化的LARG，因此，p115-RhoGEFs和LARG是GNA12/GNA13的GTP 酶激活蛋白，且它们是GNA12/GNA13 所特有的，而PDZ-RhoGEFs 不具有此功能[11]。实验表明，GNA12/GNA13 通过与RhoGEFs的相互作用诱导RhoA 的活性。同时，P115-Rho-GEFs或LARG的RH结构域表现出GNA12和GNA13的特异性GTPase 活化蛋白活性。因此，RH-RhoGEFs 在单个分子的范围内既起到了GTPase 活化蛋白的作用，又起到了GNA12 或GNA13的效应作用[12]。

Offermanns 等[13]发现GNA12/GNA13的功能十分重要。因为GNA12 敲除的小鼠表现正常，而GNA13 敲除的小鼠在胚胎第9.5 天由于其血管系统发育不正常而死亡。GNA12和GNA13 同时敲除的小鼠也在胚胎第8.5 天死亡。而只携带一个完整GNA13等位基因的GNA12 敲除的小鼠也会在子宫中死亡。GNA13 除了在胚胎循环系统中的作用外，其在人体各种病理过程中也成为了关键因素，例如，卵巢经历激素调节的变化，表现为卵巢卵泡生长并伴有卵巢的扩张。GNA13 介导的信号通路还涉及到例如VEGFR-2表达、涉及小GTPase RhoA和转录因子NF-κB 的激活[14]。

在分子诊断中也显示出GNA13的意义，Kim等[15]发现在乳腺癌，GNA12和GNA13 诱导基质金属蛋白酶（MMP）-2 上调，导致MCF10A 细胞产生侵袭和迁移表型。通过观察人的乳腺组织样本，证明了G12蛋白家族和MMP-2 的表达水平与癌症的诊断密切相关（P＜0.005）。Cheng 等[16]发现，从正常口腔粘膜标本（NOM）到口腔上皮异常增生（OED）到口腔鳞状细胞癌（OSCC），GNA12 的表达逐步升高，这表明GNA12 的过表达可能是口腔癌发生的早期表现，并且可能在口腔癌的进展中起关键作用，而GNA13 或许也有同样的作用。因此GNA12/GNA13 可能将为某些癌症提供临床诊断证据或成为新型肿瘤标志物。

3 GNA13与多种恶性肿瘤的关系

在发现G12家族后不久，GNA12和GNA13都被证明具有诱导成纤维细胞致癌转化的能力[24]。因此，GNA13与各种恶性肿瘤之间的生物学关系成为了研究者关注的焦点问题。

3.1 GNA13与乳腺癌

Rasheed 等[17]发现在乳腺癌中，GNA13 能与GPCRs 相互作用促进下游信号分子的传导，从而造成恶性肿瘤的侵袭和迁移。乳腺癌细胞是依赖于GNA13的表达来实现细胞侵袭，GNA13 参与导致乳腺癌发展的转录后基因表达机制是通过微小RNA（microRNA，miRNA）来调控的。miRNA 与目的基因的mRNA 紧密联系，同时抑制其蛋白的表达，miRNA 与编码序列或目标基因3′-UTR 的结合可致使mRNA 降解过程或蛋白翻译过程受到影响，最终抑制靶基因产生蛋白质。与前列腺癌细胞不同，乳腺癌细胞中GNA13的表达主要是通过miR-31 而不是通过miR-182和miR-200a 调控的。同时研究证明miR-31 直接与GNA13的mRNA 结合，并且这种结合会影响GNA13 表达和乳腺癌细胞侵袭。Vrba 等[18]发现，miRNA 表达失调能够显著表现出来，其中miRNA 可以充当“致癌miR”或“肿瘤抑制miR”，而这一过程其可以通过靶细胞中潜在的癌基因来实现。miR-31 在肿瘤进展中丢失，并促进乳腺癌和其他癌症的迁移。因此，确定乳腺癌和其他癌症中GNA13 调控的特定机制可能会导致针对这些癌症的基于miRNA 的治疗策略的发展。此外，miR-31 的缺失和GNA13的获得可能是评估乳腺癌和其他癌症的可行生物标志物。

3.2 GNA13与前列腺癌

Lim 等[19]发现单独阻断GNA13 会显著影响前列腺癌的癌细胞侵袭和转移。GNA13 通过Rho GTPases 发挥作用，以驱动NF-κB 转录来诱导前列腺癌细胞中CXCL5 的表达。在转移性前列腺癌细胞中，发现患者体内的CXCL5 水平显著提高，并通过促进血管生成来诱导肿瘤细胞的增殖、迁移和转移，这是由于GNA13 通过诱导内皮细胞中的VEGFR-2 或诱导细胞促进血管生成的CXCL1、CXCL2和CXCL4 来诱导肿瘤细胞血管的生成，进而影响肿瘤的生长。当列腺癌细胞中GNA13 表达沉默后，促血管生成基因会大量丢失。Rasheed等[17]发现在前列腺癌中，仅野生型GNA13的丢失就可能显著降低前列腺癌细胞在体外的浸润和转移的机会。使用特定的miRNA 抑制剂抑制LnCAP 细胞中的miR-182和miR-141/200a 可提高GNA13的表达并增强对这些细胞的侵袭。这些数据证明GNA13是前列腺癌细胞侵袭的重要介质。由于GNA13 可以充当前列腺癌细胞以及多种肿瘤细胞的致癌GPCRs 信号的共同介体，因此确定其失调机制可能会使新型miRNA 成为未来抑制癌症侵袭和转移的方法。因此，建立以GNA13 为目标的检测方法对于早期诊断前列腺癌具有重要作用，同时以miR-182 等分子为靶标进行靶向治疗的意义重大。

3.3 GNA13与肝癌

Xu 等[20]通过探讨246例肝癌患者GNA13 表达与临床病理特征的关系发现GNA13在肝癌组织中的显著上调与多种临床病理学参数相关，包括肿瘤多重性（P=0.004）、TNM 分期（P=0.002）和BCLC 分期（P=0.010），GNA13 表达是整体生存（P=0.014）和无瘤生存（P=0.005）的独立预后因素。为了确定GNA13 对肝癌细胞增殖和侵袭的影响，其建立了稳定表达GNA13的肝癌细胞HepG2和SMMC-7721。与对照组相比，GNA13的过表达在体外促进HepG2和SMMC-7721 细胞的细胞增殖；侵袭试验证明，在HepG2和SMMC-7721 细胞中过表达GNA13 会使细胞侵袭能力显著提高。通过免疫组化对肝癌细胞样本评估GNA13 蛋白的表达情况发现GNA13 蛋白主要在肝癌的细胞质中检测到，正常肝组织主要表现为GNA13 阴性表达。因此，GNA13是肝癌致瘤过程中较为关键的一个影响因素，可以作为肝癌患者的预后生物标志物，特别是在行根治性肝切除术后的患者中，其中GNA13的高表达提示肝癌患者的预后较差。

3.4 GNA13与胃癌

Zhang 等[21]发现GNA13的上调可以促进胃癌（Gastric cancer，GC）细胞的致瘤性和增殖。在GC组织和细胞中，GNA13 表达水平显著提高，并且与侵袭性的GC 进展程度和患者生存不良密切相关。当GNA13的表达水平增高时，其通过促进小鼠的细胞增殖速率、集落形成和肿瘤形成，从而增加了GC 细胞在体外和体内的增殖和致瘤性。相比之下，敲除GNA13基因能够有效地抑制GC 细胞在体外和体内的增殖和致瘤性。GNA13在GC中发挥作用的分子机制包括通过上调c-Myc，激活AKT 信号通路和ERK 信号通路，同时抑制FOXO1的活性。通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）来促使G1/ S 细胞周期发生转变，进而调节细胞周期蛋白D1和CDK 抑制剂（p21Cip1和p27Kip1）的下调。因此，以p21Cip1和p27Kip1 等作为靶标可以对GC 的早期诊断或预后进展的监测起到重要指导作用。

3.5 GNA13与头颈部鳞癌

Rasheed 等[22]发现在头颈部鳞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，NHSCC）中，GNA13是耐药性和预后不良的生物标志物，而且GNA13在体外和体内都可调节HNSCC 细胞的发生和呈现肿瘤起始样（Tumor initiating cells，TICs）表型，其通过NFκB和MAPK 信号通路促进TICs 表型和耐药性。为了确定表达高水平GNA13的肿瘤的侵袭性是否与较差的治疗反应有关，用顺铂，5-氟尿嘧啶（5-FU），紫杉醇，阿霉素或γ 电离辐射（IR）处理细胞，与低表达GNA13的细胞相比，高表达GNA13的细胞系对所有治疗方式均具有抗性。低表达GNA13的细胞中能够使得其对一些药物（例如铂类药物）的敏感性升高2～3倍。高表达GNA13的细胞更早地开始促进肿瘤发生和发展，其只需5000个细胞即可导致裸鼠成瘤。使用小分子抑制剂阻断GNA13的表达或某些下游通路的表达，可以消除GNA13 诱导的TICs 表型，使癌细胞能接受标准的细胞毒性治疗。这些数据表明，GNA13 对于HNSCC 细胞中与TICs 表型相关的所有性质都是必要的。因此，GNA13 作为NHSCC 进展的潜在预后生物标志物，干扰GNA13 诱导的信号传导就为阻断TICs和降低HNSCC 耐药性提供了新的方法，因此阻断GNA 13 诱导的MAPK/AP-1或NFκB 信号通路，确实是一种针对TICs 诱导的肿瘤生长和治疗NHSCC 耐药性的策略。

3.6 GNA13与淋巴瘤

生发中心B细胞（Germinal center B cell，GCB）来源的弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，GCB-DLBCL）是一种常见的恶性肿瘤。Muppidi 等[23]发现GNA12和GNA13在GCB 细胞中均被上调，其中以GNA13 上调更为显著。研究显示在GCB-DLBCL 活检样本中频繁出现GNA13 编码突变，GNA13 缺陷足以在肠系膜淋巴结（mLNs）中赋予GCB 细胞生长优势，而在淋巴集结（PPs）中则具有较小的优势。GNA13 突变和BCL2 重排以及可能激活的突变经常在GCBDLBCL 中同时发生。合并GNA13 缺陷和BCL2过表达的小鼠中的GCB 细胞显示出更高的离体存活率。人类P2RY8 导致了对小鼠PPs和mLNs 中GCB 细胞生长的抑制作用，类似于S1PR2 过表达的作用，而这种抑制作用要求P2RY8 与GNA13 相偶联，因为如果细胞缺少GNA13 则无法看到此生理现象。通过以上实验发现人体内的P2RY8 可以通过GNA13 依赖性途径来抑制GCB 细胞的生长并促进B 细胞在GC 位置定位。Morin 等发现健康人体内的GCB 由于受一些生理因素的影响，只能存在于生发中心内部，无法进入到循环系统之中，而缺乏GNA13 时，会使得GCB 进入血液循环。经测序研究发现，GNA13和S1PR2 突变则主要见于GCB来源的GCB-DLBCL。总之，GCB中的GNA13的丢失会造成抗细胞凋亡，同时体细胞会受到其诱导影响，发生高频突变从而产生淋巴瘤[24-25]。因此，通过检测P2RY8 的变化水平可以对GCB-DLBCL 的发生起到一定的诊断价值。

3.7 GNA13与肺癌

Grzelinski 等[26]发现在小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）细胞中，各种自分泌刺激导致GNA12/GNA13的激活。在体外实验中，GNA12/GNA13 双重敲除完全消除了小鼠的H69 致瘤性，调节SCLC 细胞增殖的GPCRs 与GNA12/GNA13偶联，导致Gq/11 磷脂酶C-Ras-细胞外信号调节激酶1/2和GNA12/GNA13-Rho 信号传导途径的各自激活。在其他肿瘤中，GNA12/GNA13 激活可促进侵袭性而不影响细胞增殖，而GNA13的高表达在SCLC 中发挥增殖作用。GNA13的下调会明显抑制体内外的增殖，体内数据还显示了GNA12和GNA13 耗竭的累加效应，两种蛋白质的双重靶向作用能导致肿瘤生长的完全消除，这一开创性发现进一步支持了完整的GNA12/GNA13 信号传导是SCLC 中肿瘤生长的先决条件的概念。

3.8 GNA13与胰腺癌

Gardner 等[27]近期的研究表明，肿瘤微环境在胰腺癌等一些疾病的进展中的发挥着重要的作用，例如GNA13在溶血磷脂酸刺激引起的胰腺癌细胞侵袭性迁移中就产生了重要影响，从而影响着胰腺癌疾病的进展。研究证明LPA 特异性刺激胰腺癌细胞的迁移但不刺激其增殖，LPA 刺激的胰腺癌细胞的侵袭性迁移受到竞争抑制性基因GNA13 表达的抑制，并且shRNA 介导的GNA13沉默也证明了LPA 刺激的胰腺癌细胞迁移的类似抑制作用。GNA13是参与LPA 介导的胰腺癌迁移的α 亚基，即敲除GNA13 会导致细胞迁移受到抑制，这为胰腺癌的早期诊断提供了新的思路。

4 展望

GNA13在人体中的作用机制众多且独特，已被证明是癌细胞增殖、侵袭、迁移和转移的重要调节剂[14，28]。虽然GNA13的高表达与常见肿瘤进展密切相关，并且GNA13所参与最重要的信号通路之一就是RhoGEFs家族所介导的，但仍需进一步研究以充分阐明GNA13 参与肿瘤转移和进展的确切机制。相信通过深入研究GNA13 对细胞的增殖分裂、细胞骨架的重排、细胞的迁移与侵袭等生理病理活动产生的影响，阐明其发挥作用的分子机制，未来有望使其成为一个新的治疗靶点。