滑膜组织Galectin-3、BMP-2蛋白在骨关节炎患者中的表达及临床价值

赵丽莉 高宇 梁涢 罗毅

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种滑膜关节退行性疾病，在病程中滑膜组织可通过分泌致炎因子，造成软骨下骨硬化、关节软骨丢失、疼痛等，影响关节正常功能，致残率较高，严重降低患者生活质量，因此加强对OA 的研究具有重要意义[1]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）可调控细胞生长、凋亡等，在人工椎间盘病变患者标本中可检测到阳性表达，与椎间盘退变有关，并具有体外诱导炎症因子表达的功能，故推测其可能与OA 有关[2]。骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）能促进成骨细胞分化，加速前十字韧带重建后的骨愈合，但在OA 中的研究较少[3]。本研究探究滑膜组织Galectin-3、BMP-2 在OA患者中的表达及临床价值，报告如下。

1 资料和方法

1.1 主要试剂

兔抗人Galectin-3 单克隆一抗、生物素化的二抗（美国Santa Cruz公司）；兔抗人BMP-2 单克隆一抗、生物素化的二抗（北京百奥莱博科技有限公司）；DAB 显色剂（上海信裕生物科技有限公司）。

1.2 一般资料

选取本院2017年6月至2019年8月收治的OA患者126例作为观察组，另选取同期因膝关节韧带损伤或半月板损伤行关节镜诊治术患者124例作为对照组。两组性别、年龄、体质量指数、患病侧、饮酒史、吸烟史、合并疾病等资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），但有可比性。

纳入标准：①OA组均符合OA 诊断标准[4]；②临床资料完整；③无认知、精神障碍；④单侧病变者；⑤所有患者及家属均已签署知情同意书。排除标准：①合并系统性红斑狼疮者；②伴有血液系统疾病者；③存在恶性肿瘤者；④合并严重凝血功能障碍者；⑤伴有急性感染类疾病者。根据WOMAC 骨关节炎指数[5]评估判断病情程度研究经本院伦理委员会同意批准。

表1 两组临床资料对比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

表1 两组临床资料对比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

资料年龄(岁)性别（男/女）体质量指数（kg/m2）患病侧左侧右侧饮酒史吸烟史合并疾病高脂血症糖尿病心脏病高血压观察组（n=126）55.49±4.10 66/60 22.25±1.79 58（46.03）68（53.97）57（45.24）51（40.48）20（15.87）9（7.14）5（3.97）6（4.76）对照组（n=124）55.18±4.42 59/65 22.31±1.73 63（50.81）61（49.19）52（41.94）56（45.16）16（12.90）11（8.87）3（2.42）4（3.23）t/χ2值0.575 0.576 0.269 0.571 0.277 0.560 0.447 0.254 0.113 0.088 P值0.566 0.448 0.788 0.450 0.599 0.454 0.504 0.615 0.737 0.767

1.3 方法

1.3.1 滑膜组织Galectin-3、BMP-2表达

采用免疫组化染色法检测，滑膜组织标本固定，脱水，包埋，连续切片，60℃恒温箱中烤片过夜，脱腊至水。3%双氧水冲洗载玻片，PBS 液冲洗3次×5 min，复合酶37℃修复标本10 min，按照1∶100 比例滴加兔抗人Galectin-3、BMP-2 单克隆一抗，37℃湿盒孵育1.5 h，室温下复温0.5 h，PBS冲洗3次×5 min。滴加生物素化的二抗，室温静置0.5 h，PBS 洗3次×5 min。滴加DAB 显色剂显色5 min，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察，细胞膜、细胞核或细胞质有棕色颗粒附着为阳性，仅有片状、黄染或无颗粒附着为阴性，通过IMage-Pro Plus6.0软件分析，200倍镜下随机选取5个视野，滑膜组织Galectin-3、BMP-2阳性表达率为滑膜组织阳性染色面积占视野下组织总面积的平均光密度。

1.3.2 关节液炎症标记物检测

严格无菌操作，抽取患膝关节液1 mL，3 000 r/min 离心10 min 采用酶联免疫吸附法检测上清白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）表达，IL-6试剂盒购于艾美捷科技有限公司，IL-8 购于武汉赛培生物科技有限公司，TNF-α购于齐一生物科技（上海）有限公司。

1.4 观察指标

①比较两组滑膜组织Galectin-3、BMP-2 水平/浓度的差异。②分析滑膜组织Galectin-3、BMP-2与OA 诊断的关系。③比较不同OA 严重程度患者滑膜组织Galectin-3、BMP-2表达。④比较不同OA 严重程度患者关节液炎症标记物（IL-6、IL-8、TNF-α）水平。⑤分析滑膜组织Galectin-3、BMP-2与关节液炎症标记物相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计数资料用n（%）表示、χ2检验，计量资料以（）表示，多组间比较以单因素方差分析，两两比较以LSD-t 检验，采用Logistic 分析滑膜组织Galectin-3、BMP-2与OA 发病的关系，采用Pearson 分析滑膜组织Galectin-3、BMP-2 与关节液炎症标记物相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组滑膜组织Galectin-3、BMP-2阳性表达率比较

观察组滑膜组织Galectin-3、BMP-2阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

2.2 滑膜组织Galectin-3、BMP-2与OA发病的关系

Logistic回归分析显示，滑膜组织Galectin-3、BMP-2 与OA 诊断显著相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 两组滑膜组织Galectin-3、BMP-2 比较（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

表2 两组滑膜组织Galectin-3、BMP-2 比较（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

组别观察组对照组t值P值n 126 124 Galectin-3（%）42.47±6.78 5.82±1.39 58.985＜0.001 BMP-2（%）28.63±5.26 8.72±2.14 39.086＜0.001

表3 滑膜组织Galectin-3、BMP-2 与OA 发病的关系Table3 Relationship between galectin-3，BMP-2 and the incidence of OA in synovial tissue

2.3 不同OA 严重程度患者滑膜组织Galectin-3、BMP-2 的比较

滑膜组织Galectin-3、BMP-2阳性表达率随病情程度增加呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.4 不同OA 严重程度患者关节液炎症标记物

关节液IL-6、IL-8、TNF-α 水平随病情程度增加呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

2.5 滑膜组织Galectin-3、BMP-2 与关节液炎症标记物相关性

Pearson 相关性分析，滑膜组织Galectin-3 与关节液IL-6（r=0.515）、IL-8（r=0.635）、TNF-α（r=0.620）呈正相关，滑膜组织BMP-2 与关节液IL-6（r=0.602）、IL-8（r=0.499）、TNF-α（r=0.634）呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

表4 不同病情程度患者滑膜组织Galectin-3、BMP-2比较（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

表4 不同病情程度患者滑膜组织Galectin-3、BMP-2比较（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

组别轻度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 Galectin-3（%）31.77±5.83 42.08±6.29 55.86±7.10 124.278＜0.001 BMP-2（%）20.05±4.16 27.44±5.27 40.90±6.74 132.326＜0.001

表5 不同病情程度患者关节液炎症标记物比较（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

表5 不同病情程度患者关节液炎症标记物比较（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

组别轻度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 IL-6（ng/L）13.15±3.82 35.94±10.20 61.08±16.33 169.027＜0.001 IL-8（ng/L）6.01±1.80 9.53±3.04 14.29±4.11 63.706＜0.001 TNF-α（ng/L）0.52±0.20 1.23±0.57 2.14±0.68 83.291＜0.001

3 讨论

目前普遍认为，OA是一种由滑膜、软骨、骨等参与的炎症性疾病，其炎症通路是由IL-6、IL-8、TNF-α 等多种细胞因子参与的，各炎症因子水平被证实与OA患者病情有关，能持续刺激滑膜、软骨等，造成组织损伤，并诱导成纤维细胞、基质金属蛋白酶分泌，导致滑膜增生、边缘骨赘形成、关节间隙变窄等，从而诱发OA[6-7]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族中一个结构独特的成员，在多种组织中均有表达[8]。抑制Galectin-3 表达能明显下调基质金属蛋白酶3 表达，抑制核因子-κB 信号通路，减轻脂多糖诱导的软骨细胞炎症损伤，呈现出软骨保护特性[9]。本研究显示，OA患者滑膜组织Galectin-3 表达高于因膝关节韧带损伤或半月板损伤行关节镜诊治术患者，与OA诊断显著相关，并随病情严重程度增加呈升高趋势。分析其原因，Galectin-3 可刺激成纤维细胞生长，被激活的成纤维细胞可附着于骨组织和软骨，逐渐破坏关节结构，并介导细胞黏附、白细胞趋化，参与炎症反应、组织纤维化，造成关节损伤，故在OA 中高表达，与OA 发病及患者病情有关[10-11]。Weinmann 等[12]报道显示，Galectin-3 可诱导人骨关节炎中的IL-6、TNF-α 等，是OA 进展的分子开关，支持本研究中滑膜组织Galectin-3 与关节液IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相关的观点，佐证了Galectin-3 能通过炎症因子参与OA 的发病。可见从基因水平靶向Galectin-3，沉默或抑制Galectin-3 表达，可能有助于改善OA 的炎症反应情况，缓解或控制OA 病情，但这一结论仍需更多研究的论证。

BMP-2是驱动成骨细胞分化和活性的必不可少的生长因子，对骨形成至关重要[13]。本研究显示，OA患者滑膜组织BMP-2表达高于因膝关节韧带损伤或半月板损伤行关节镜诊治术患者，与OA发病显著相关，与Weidner 等[14]报道相似，可能是由于OA 滑膜组织的炎症反应刺激及退行性变化，导致BMP-2 升高，进而参与关节软骨的修复。且本研究还发现，滑膜组织BMP-2阳性表达率随病情程度增加呈升高趋势，表明BMP-2 与OA患者病情有关，推测病情越严重，软骨破坏可能更明显，机体为修复软骨产生适应性或应激性变化更大，分泌更多的BMP-2，以发挥修复作用[15]。同时滑膜组织BMP-2 与IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相关，这一现象是由于OA 局部的激烈炎症反应可能通过细胞因子网络系统启动了滑膜组织的成骨性能，从而使BMP-2 与促炎因子呈现出正相关变化[16]。而根据以往报道，IL-6、IL-8、TNF-α 均与OA 临床症状严重程度、关节功能显著相关，佐证了Galectin-3、BMP-2 与OA 发病和病情有关[17]。提示治疗OA 时，不仅应重视关节炎症反应的控制，亦应从软骨修复等角度干预，双管齐下，可能有助于提高临床治疗效果。

综上所述，滑膜组织Galectin-3、BMP-2 在OA患者中呈高表达，与OA 的发病和病情严重程度显著相关，并与关节液炎症因子表达呈正相关，提示检测滑膜组织Galectin-3、BMP-2 可辅助OA及其严重程度的诊断和预后的判断。