miR-182-5p调节细胞自噬促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

相绿竹 王晔 陈文 赵琦 彭瑞 牟晓峰★

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国消化道恶性肿瘤中居首位，2015年中国胃癌的患病人数为679 100，其中死亡人数为498 000[1]。早期胃癌多无明显症状，大约有80%的胃癌患者在确诊时已属中晚期或发生转移，长期生存率仍然比较低[2]。因此进一步探讨胃癌的发病机制，寻找胃癌的分子治疗靶点具有重要的临床意义。已有研究表明miR-182-5p 参与肺癌[3]、肝癌[4]以及乳腺癌[5]等肿瘤的发生发展，但miR-182-5p在胃癌中的作用存在争议[6-7]。自噬在胃癌的发生发展过程中具有双重要作用，这可能与胃癌的分子类型、分期以及涉及的通路有关[8-9]。生物信息学分析表明miR-182-5p 可直接或间接作用于自噬通路的关键基因来调控胃癌细胞自噬，但胃癌中的miR-182-5p 的表达、自噬水平以及两者对细胞增殖、迁移和侵袭的影响尚不明确。因此本研究通过探讨miR-182-5p调节自噬对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，为寻找胃癌的分子治疗靶点提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 组织标本和细胞培养

收集的16 对胃癌和相应癌旁组织标本（距癌组织2 cm，经本医院病理医师鉴定癌旁组织无癌变），均来自青岛市中心医院2015年至2018年手术后取得，肿瘤淋巴结转移分期（Tumor，Node，Metastasis，TNM）为T2N0M01B 期。患者年龄47～74岁，中位年龄63岁。患者参与前均签署知情同意书，标本收集符合本院伦理委员会的要求。人胃癌细胞株BGC-823和正常胃上皮细胞GES-1 购自湖南丰晖生物科技有限公司，细胞系均用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的1640 培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养。特殊化学修饰的微小RNA 激动剂（miR-182-5p agomir）可增加miR-182-5p 的表达，特殊化学修饰的微小RNA 拮抗剂（miR-182-5p antagomir）可降低miR-182-5p 的表达，分别以特殊化学修饰的微小RNA 激动剂无模板对照物（miR-182-5p agomir no template control，miR-182-5p agomir NTC）和特殊化学修饰的微小RNA 拮抗剂无模板对照物（miR-182-5p antagomir no template control，miR-182-5p antagomir NTC）为对照，分为miR-182-5p agomir NTC组与miR-182-5p agomir组、miR-182-5p antagomir NTC组与miR-182-5p antagomir组。

1.2 主要仪器和试剂

实时定量聚合酶链式反应仪器购自美国Applied Biosystem公司，免疫印迹装置购自美国Bio-Rad公司，显微镜购自德国Carl Zeiss公司。miR-182-5p agomir 与miR-182-5p agomir NTC、miR-182-5p antagomir 与miR-182-5p antagomir NTC 购自广州锐博生物科技有限公司；Master Mix试剂购自美国Applied Biosystem公司；抗体购自英国Abcam公司[抗脂质体1（Sequestosome1，SQSTM1或P62）抗体的货号ab56416，抗Beclin1 抗体的货号ab207612，抗微管相关蛋白1 轻链3B（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）抗体的货号ab51520]；腺病毒-荧光标签蛋白-微管相关蛋白1 轻链3B 购自中国上海汉恒生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时定量聚合酶链式反应检测miR-182-5p的表达

Trizol 法提取总RNA 后，反转录为cDNA。以cDNA 为模板，用特异性引物（has-miR-182-5p-F：GGG TTT GGC AAT GGT AGA ACT CA，has-miR-182-5p-R：CCA GTG CAG GGT CCG AGG T）进行扩增，以U6（U6-F：CTC GCT TCG GCA GCA CA，U6-R：AAC GTT CAC GAA TTT GCG T）为内参。体系如下：模板4.6 μL，引物0.4 μL，Master Mix 5.0 μL。反应程序为95℃3 min，95℃15 s、60℃1 min，执行40个循环。

1.3.2 细胞荧光检测自噬水平

以2×104个/孔的细胞密度种于已放置爬片的48 孔板中，培养12 h 后进行干预，同时每组均加HBAD-GFP-LC3B 病毒。继续培养4 h 后，更换培养基，并补加干预物质，48 h 后，预冷甲醇固定、4，6-联脒-2-苯基吲哚染色，封片后于显微镜下拍照统计。

1.3.3 免疫印迹法检测蛋白的表达

细胞样品提取总蛋白，并测定浓度。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰上转聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），室温封闭1 h 后，加入一抗（抗Beclin1 抗体、1∶5 000，抗P62 抗体、1∶1 000，抗LC3B 抗体、1∶3 000）4℃过夜孵育，用含0.05%吐温-20 的缓冲盐溶液（Tris 10 mM，NaCl 150 mM，pH7.5）洗膜后，加入二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，洗膜后显影成像。

1.3.4 CCK-8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测细胞增殖

以8×103个/孔的细胞密度种于96 孔板中，12 h后进行干预，培养1、2、3、4 d。每孔加入10 μL CCK-8试剂后，孵育2 h，用酶标仪检测各孔的光密度值。

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移

以6×105个/孔的细胞密度种于6 孔板中，12 h后进行划痕，磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH 7.5）清洗3次后，于显微镜下拍照。每孔加入无血清培养基并进行干预，继续培养72 h 后，于显微镜下拍照并计算细胞迁移率。

1.3.6 侵袭实验检测细胞侵袭

提前将Transwell 小室（一种有通透性的支架或膜滤器）的上室用基质胶涂覆，然后将无血清培养基重悬的细胞悬液，以2×104个/小室的密度接种于上室，下室中加入500 μL 含有10%胎牛血清的培养基，培养12 h 后进行干预。48 h 后，4%多聚甲醛固定15 min、0.1%结晶紫染色5 min，磷酸盐缓冲液淋洗后，于显微镜下拍照并统计。

1.4 统计学方法

统计学处理采用Graph Pad Prism 5 软件自带的统计学分析模块进行。计数资料以%表示计量资料的表达用（）的形式表示。正态分布资料两组之间的比较采用t检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-182-5p在胃癌组织和BGC-823细胞株中表达升高

相比于癌旁组织，胃癌组织中miR-182-5p 的表达上调，差异有统计学意义（t=2.421，P＜0.05）（图1A）；同样，BGC-823细胞中miR-182-5p 的表达显著高于正常胃上皮细胞GES-1，差异有统计学意义（t=6.757，P＜0.05）（图1B）。

2.2 miR-182-5p增强胃癌细胞株BGC-823的自噬水平

相比于对照组，miR-182-5p agomir组自噬细胞百分比增加，自噬相关蛋白Beclin1增加、P62减少、LC3B-Ⅱ/Ⅰ增加，整体自噬水平增强，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图2A，图2B），而miR-182-5p antagomir组整体自噬水平减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2，图2C，图2D。

2.3 miR-182-5p促进胃癌细胞株BGC-823的增殖

相比于对照组，miR-182-5p agomir组细胞增殖能力增强，而miR-182-5p antagomir组细胞增殖能力降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 miR-182-5p促进胃癌细胞株BGC-823的迁移

相比于对照组，miR-182-5p agomir组划痕面积明显减小（划痕闭合百分比% 65.67±7.77vs45.33±11.93），细胞迁移能力明显增强，而miR-182-5p antagomir组细胞迁移能力减弱（划痕闭合百分比%25.67±5.89vs44.33±9.29），差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

表1 miR-182-5p 过表达对胃癌细胞BGC-823 自噬水平的影响（±s）Table1 The effects of miR-182-5p overexpression on autophagy in BGC-823 cells（±s）

表1 miR-182-5p 过表达对胃癌细胞BGC-823 自噬水平的影响（±s）Table1 The effects of miR-182-5p overexpression on autophagy in BGC-823 cells（±s）

注：与agomir NTC组比较，a P＜0.05。

分组agomir NTC agomir t值P值自噬细胞百分比36.670±10.020 48.330±7.506a 8.030 0.015 Beclin1 1.059±0.181 1.395±0.172a 8.382 0.014 P62 1.053±0.189 0.665±0.115a 5.878 0.027 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.080±0.252 2.340±0.396a 15.130 0.004

表2 miR-182-5p 低表达对胃癌细胞BGC-823 自噬水平的影响（±s）Table2 The effects of low expression of miR-182-5p on autophagy in BGC-823 cells（±s）

表2 miR-182-5p 低表达对胃癌细胞BGC-823 自噬水平的影响（±s）Table2 The effects of low expression of miR-182-5p on autophagy in BGC-823 cells（±s）

分组antagomir NTC antagomir t值P值自噬细胞百分比37.000±11.140 28.330±9.504 7.211 0.019 Beclin1 1.023±0.156 0.671±0.132 16.87 0.004 P62 1.017±0.355 1.557±0.221 4.356 0.049 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.085±0.258 0.503±0.166 5.916 0.027

2.5 miR-182-5p促进胃癌细胞株BGC-823的侵袭

miR-182-5p agomir组通过基质胶的细胞数多于其对照组（970.0±180.0vs747.0±106.7），miR-182-5p antagomir组通过基质胶的细胞数少于其对照组（537.0±84.5 vs 750.3±152.5）个，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）主要参与转录水平基因表达的调控，在肿瘤发生和转移中发挥重要作用。miR-182-5p在胃癌的发生发展中的作用还存在争议，有研究发现与健康人群相比，胃癌患者血清中miR-182-5p 的表达升高，可以作为潜在的生物标志物[6]；Ramadan 等[10]人也发现胃癌患者的外周血和组织中miR-182-5p 的表达升高，且与患者较短的生存期和不良预后相关；有研究发现胃癌细胞HCG-27 中miR-182-5p 表达上调，且miR-182-5p 可通过下调Ras 相关蛋白Rab-27A（Ras-related protein Rab-27A，RAB27A）促进胃癌细胞的增殖和迁移[11]，这提示miR-182-5p 可促进胃癌的发生发展。然而，有研究发现miR-182-5p在胃癌组织中显著低表达，过表达miR-182-5p 可抑制胃癌细胞的增殖以及集落形成，同时发现胃癌细胞中癌基因ANUBL1[即锌指，AN1型结构域4（zinc fnger，AN1-type domain 4，ZFAND4）]与miR-182-5p 形成负反馈环路，共同调节胃癌的进展[7]。存在以上差异可能是由于研究者所研究的细胞来源和类型不同所致，也可能与miR-182-5p和其上下游复杂的调控网络之间相互作用有关。本研究发现在16 对胃癌组织和胃癌细胞BGC-823中miR-182-5p 表达升高，且下调miR-182-5p 的表达时，胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱，支持了miR-182-5p 作为促癌分子的假设，为进一步的机制研究提供了新的实验依据。

miRNA 可以直接或间接作用于自噬通路的关键基因，调控细胞自噬，进而影响肿瘤的发生发展。最近的研究发现，miR-423-3p 通过调节与B淋巴细胞瘤-2蛋白相互作用介导细胞死亡的调节分子（B-cell lymphoma-2 interactig mediator of cell death，Bim）的表达能够激活具有促癌作用的自噬过程，促进肿瘤发展[12]，Fan H 等[13]人也发现miRlet-7a 在胃癌细胞中通过靶向雷帕霉素不敏感的mTOR 分子伴侣（Rapamycin-insensitive companion of mTOR，Rictor）调节自噬过程，促进胃癌的发生发展，这提示降低miR-423-3p和miR-let-7a 的表达可以降低胃癌细胞自噬水平，从而达到抑制肿瘤生长的目的。当然也有研究发现miR-1265 可以通过降低钙结合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39）的表达，进而调节一磷酸腺苷激活蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶点（Adenosine Mono Phosphate-activated protein kinase-mammalian target of rapamycin，AMPK-mTOR）信号传导途径来抑制胃癌细胞自噬，进而抑制胃癌细胞的增殖，促进胃癌细胞的凋亡，为胃癌的治疗提供潜在的治疗靶点[14]。miRNA 对自噬的调控存在的这些差异可能与miRNA 分子的不同、所研究的胃癌分期不同以及信号通路的不同有关，需要明确miRNA 在自噬过程和肿瘤生长转移中的作用，从而更好地为治疗提供理论依据。本研究发现miR-182-5p 表达上调时，细胞自噬水平增强，提示胃癌细胞可通过自噬过程进行自我更新，进一步促进胃癌的发生发展。

本研究将miR-182-5p 与细胞自噬相结合，不仅丰富了miRNA 的研究内容，也为自噬的研究提供了不同的途径。根据TargetScan 等数据库预测可知，B 淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）是miR-182-5p 的靶基因之一，其负调控Beclin 1 的表达，增强细胞自噬水平，但miR-182-5p对自噬调控的具体分子机制仍需进一步研究。总的来说，本研究发现miR-182-5p 可能通过增强细胞自噬水平，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这提示miR-182-5p 可作为胃癌治疗的一个潜在靶点，进一步为胃癌的治疗提供一定的参考。