牡蛎提取物辅助保护化学性肝损伤功效研究

刘淑集，许 旻，苏永昌，廖登远，陈晓婷，乔 琨，蔡水淋，潘 南，陈 贝，王 茵，苏 捷，刘智禹

[福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门)，福建 厦门 361013]

肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病，主要分为2类，即病理性肝损伤和化学性肝损伤。其中，化学性肝损伤是指由某些药物、环境中的化学有毒物质或者酒精等对肝脏造成的损害[1]，会引起多种肝脏疾病如肝硬化、肝癌、肝纤维化等[2-3]，以药物性和酒精性肝损伤最为常见。现代人因为饮酒过量引起肝损伤的现象越来越普遍，这是因为进入人体后、超过95%的酒精是在肝脏中进行代谢，并转化成具有高毒性的乙醛而损坏肝脏[4]。目前对肝损伤的防治仍是一个全球性的严峻课题[5]，因而开展天然产物对肝损伤的保护、预防或治疗的研究具有重要意义。

牡蛎是世界上第一大养殖贝类，在我国也是四大养殖贝类之一。牡蛎味道鲜美，富含锌、牛磺酸、蛋白质、多糖等营养成分，具有较高的药用价值。目前诸多的报道显示牛磺酸和糖原具有良好的解酒护肝作用[6-7]。杨勇进等研究结果表明牡蛎提取物可以有效地减缓酒精性肝损伤大鼠的interleukin-17(IL-17)、tumor necrosis factor alpha(TNF-α)及转氨酶水平的升高，有明显的保肝降酶作用[8]。李旭等也研究了牡蛎提取物对小鼠肝脏保护作用研究，表明牡蛎粉提取物能提高小鼠肝内乙醇脱氢酶活性，在护肝的同时具有一定的解酒作用[9]。淑英等研究结果表明富锌牡蛎粉可降低酒精致肝损伤小鼠天冬氨酸转氨酶(Aspartate transaminase，AST)、谷丙转氨酶(Alanine transaminase，ALT)、半乳糖基葡萄糖基转移酶(Galactosyl glucosyltransferase，GCT)活性及丙二醛(MDA)含量，增强谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase(SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性，对肝损伤具有一定的保护作用，这可能与其增强抗氧化能力和抑制脂质氧化有关[10]。黄健等研究表明牡蛎能提高小白鼠醉酒耐受时间，缩短醉酒时间，具有一定的预防醉酒作用，对酒精性肝损伤有明显的保护作用，其机制可能与抗氧化及改善肝组织病变有关[11]。因每位研究学者制备牡蛎提取物的方法不一致，导致所获得的提取物成分也会有所不同。因此，本文通过50%乙醇建立急性肝损伤模型，拟从血清生化指标、肝脏脂肪变性等情况研究实验室自制的牡蛎提取物对小鼠急性肝损伤的辅助保护作用，以期为开发保肝护肝功效的牡蛎保健食品提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

牡蛎提取物自制，参照文献[12]的方法进行提取制备，将牡蛎肉匀浆，加入2倍水、胰蛋白酶(7 500 U/g)和风味蛋白酶(450 U/g)，调pH 8.0，在50℃条件下酶解5 h，100℃灭酶10 min，冷却，三层纱布过滤，滤液依次通过陶瓷膜(200目)、截留分子量为5 000 Da和1 000 Da的超滤膜及纳滤膜，冻干，获得牡蛎提取物，其中蛋白质含量70.6%、灰分5.5%、脂肪2.8%、水分4.7%，通过凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)测定分子量低于1 000 Da的占93%以上。

1.2 实验动物及环境

SPF级ICR种雄性小鼠50只，体重18～22 g，每组10只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2016-0002。实验动物使用许可证号SYXK(湘)2015-0012。实验环境为屏障环境，温度为22～25℃，湿度为46%～48%。

1.3 主要仪器与试剂

722S分光光度计、恒温水浴锅、离心机、组织匀浆器、混悬器、加样器、BECKMAN COULTER AU680全自动生化分析仪。

还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物处理

设定牡蛎提取物的剂量为0.375、0.750、2.250 g/kg•bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)，分别为低、中、高剂量组，同时设定正常组和肝损伤模型组，每组10只。分别称取牡蛎提取物3.75、7.50、22.50 g，并分别加蒸馏水至200 mL进行溶解，每天对小鼠灌胃1次，灌胃体积为0.2 mL/10 g•bw，连续30 d，正常组和肝损伤模型组给予等体积蒸馏水。实验期间，小鼠每两周称重一次，并记录数据。第30天，对各剂量组和模型组给予50%乙醇(12 mL/kg)灌胃，造成急性肝损伤模型，正常组给予蒸馏水灌胃，禁食16 h处死动物，进行各项指标检测及病理组织学检查。

1.4.2 指标检测

取肝脏用生理盐水制成10%的肝匀浆，检测肝组织中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量，按照南京建成生物工程研究所提供的测试盒说明书进行测定。

1.4.3 病理组织学检查

从小鼠肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹红染色。镜检时从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片，观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积，并按以下标准进行评分：0分，肝细胞内脂滴散在、稀少；1分，含脂滴的干细胞不超过1/4； 2分，含脂滴的肝细胞不超过1/2；3分，含脂滴的肝细胞不超过3/4；4分，肝细胞几乎被脂滴代替。

1.5 实验数据统计

实验数据采用SPSS软件进行统计分析，结果都以平均值(Mean)±标准差(SD)表示，用One way-ANOVA进行单因素方差分析。

1.6 结果判定

肝组织中MDA、GSH、TG三项检测指标结果阳性，或肝组织中MDA、GSH、TG三项指标中任两项指标阳性和病理检测结果阳性，均可判定受试样品对化学性肝损伤具有辅助保护功效。

2 结果与分析

2.1 牡蛎提取物对动物体重的影响

小鼠灌胃牡蛎提取物30 d期间，对各组小鼠的体重进行监测，观察小鼠体重增重情况，结果如表1所示。各剂量组小鼠体重经饲喂30 d 后，体重均增加了18～20 g；与空白组相比，模型组的体重增加量有稍微少一些，但是差异没有显著性(P>0.05)。各剂量组小鼠的体重增加量呈递增趋势，但是各组之间也无显著性差异(P>0.05)。

2.2 牡蛎提取物对肝组织中MDA、GSH、TG含量的影响

由图1、图2可知，模型组的MDA、TG水平均极显著高于空白组(P<0.01)，分别是空白组的1.77、1.49倍，而模型组的GHS水平极显著低于空白组(P<0.01)，仅为空白组的63.8%。牡蛎提取物各剂量组能够抑制MDA的升高，且随着剂量的增加，抑制效果更显著，其中高剂量组的MDA水平降到模型组的64.8%，接近空白组的水平。各剂量组的牡蛎提取物能够提高GSH水平，且呈剂量效应，高剂量组的GSH水平比模型组提高了0.49倍。随着牡蛎提取物剂量的增加，TG水平逐渐降低，高剂量组的TG水平明显降低到模型组的72.5%，有差异显著性(P<0.05)。

2.3 牡蛎提取物对肝组织病理的影响

小鼠饲喂30 d后，观察了小鼠的肝组织脂肪变性程度，结果如表2所示。模型组肝脏脂肪变性的程度是空白组的10.33倍，差异极显著(P<0.01)；牡蛎提取物各剂量组肝脏脂肪变性程度有稍微缓解，且剂量越大，缓解程度越大；高剂量组的肝脏脂肪变性程度降低到模型组的61.0%，说明牡蛎提取物可以修复由酒精刺激引起的肝脏脂肪变性。

表2 牡蛎提取物对小鼠肝脏组织脂肪变性的程度的影响

注：Δ与正常组相比，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01；*与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。图1、图2同此。

Note：ΔCompared to normal group，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01；*Compared to model group，*P< 0.05，**P< 0.01.The same as Fig.1 and Fig.2.

3 讨论

由于我国的饮食文化丰富，其中酒桌文化在增进人们之间感情的同时，也深深影响着人们的身体健康。目前，我国酒精性肝病的发病率高达20%[13]，因此，对于酒精肝的预防与治疗已成为人们迫切需要解决的重要问题。虽然临床上有许多治疗性药物，但是人们更倾向于通过饮食代替药物来防治，所以对于采用功能性食品来防治酒精性肝损伤正成为研究的热点。酒精在人体内通过氧化反应进行代谢，会消耗GSH，产生自由基，其代谢产物乙醛会被黄嘌呤氧化酶转变成超氧化物，进而导致脂质过氧化，导致肝脏损伤[14]。MDA是脂质过氧化的终产物，能用于判断体内脂质过氧化的程度；GSH是体内重要的抗氧化物质，其水平的高低可以标示酒精性肝损伤时肝脏抗氧化能力的强弱[15]；TG则可以看出脂肪在肝细胞中堆积的情况[1]。

本研究中，分别给予小鼠以0.375、0.750、2.250 g/kg•bw为剂量的低、中、高剂量组牡蛎提取物经口灌胃30 d后，以酒精造成急性肝损伤模型。模型组的MDA含量显著升高，牡蛎提取物各剂量组的MDA水平随着剂量的增加，逐渐下降，高剂量组的MDA水平降到接近空白组水平；模型组GSH水平显著下降，而牡蛎提取物各剂量组的GSH水平提高，说明小鼠体内发生了比较激烈的氧化反应，产生了大量自由基，但灌胃牡蛎提取物后，GSH水平提高，以供机体对抗过氧化反应，抑制脂质过氧化反应。这与淑英等[10]的研究结果一致，其研究表明富锌牡蛎粉对小鼠酒精性肝损伤的保护作用，可能与增强机体抗氧化能力和抑制脂质氧化有关。肝脂肪变性是由于肝脏肝细胞细胞浆内出现了脂肪滴，重度的脂肪变性可引起肝功能衰竭，甚至引起肝细胞坏死[16]。李文立等给小鼠灌胃了牡蛎粉，发现小鼠肝细胞气球样变的动物例数明显减少，病变程度减轻，对四氯化碳(CCl4)化学性肝损伤具有保护作用[17]。本实验中，模型组的TG含量升高，牡蛎提取物各剂量组的TG含量有所降低；模型组肝脏的脂肪变性程度严重，达10余倍，灌胃不同剂量组的牡蛎提取物后，可以不同程度地缓解脂肪变性。由此可以推断牡蛎提取物可能是通过增强体内抗氧化酶水平，对抗自由基生成，防止肝脏发生脂肪变性。依据《保健食品检验与评价技术规范2003版》的判定标准[18]，本实验中MDA、GSH和TG等3项指标检测结果均为阳性，判定牡蛎提取物对化学性肝损伤具有一定的辅助保护作用，可以作为一种具有保肝护肝功效的海洋保健食品进行开发。由于本文中牡蛎提取物的主要成分为牡蛎多肽，因此，今后对于牡蛎多肽的保肝护肝功效及其确切机制有待进一步研究。