海参皂苷的提取条件研究

李鑫佳，姜爱莉

(烟台大学生命科学学院，山东 烟台264000)

海参(Sea cucumber，Holothurian)，又名海鼠、海地瓜，是一种珍贵的海洋生物，海参富含蛋白质，含有少量脂肪，几乎不含胆固醇，是优良的滋补食品[1]。作为我国的一种传统中药，海参有着养血润燥、补肾益精等功效，自古以来便是滋补的名贵食品和防治一些疾病的良药[2]。近年来，海参中多种具有调节生理活性的功能性化学物质被陆续分离获得，如海参多糖[3]、三萜皂苷[4]、脂肪酸[5]、多肽[6]、神经节苷脂[7]等。

海参皂苷是一类活性很强的物质，在海参体壁和内脏中分泌得到。海参皂苷为三萜皂苷，其结构多为羊毛甾烷型[8]。海参皂苷是由苷元和糖链通过β-O糖苷键结合而成，苷元常为四环三萜和五环三萜，组成寡糖苷的单糖主要有：木糖、葡萄糖、喹喏糖(quinose)、3 - 甲基木糖、3 - 甲基葡萄糖等[9]。按照苷元的类型，海参皂苷可以分为两种：海参烷型和非海参烷型；海参烷型苷元一般为 18(20)-内酯环，非海参烷型苷元有18(16)-内酯环或无内酯环结构[10]；比较常见的为海参烷型，偶有非海参烷型。海参皂苷的分离纯化过程繁琐复杂，要得到单体化合物具有很大困难。经研究发现海参皂苷具有抗真菌、抗肿瘤、溶血以及免疫调节等多种药理活性。尹艺等[11]研究指出，海参皂苷具有防辐射、延缓衰老、预防骨质疏松、提高免疫力及记忆力、改善尿频症状等多重功效。丛日山等[12]进行的研究中发现，海参皂苷具有抗真菌的作用。童静静等[13]研究指出，海参皂苷具有抑制肿瘤细胞生长和扩散的作用。罗臻等[14]研究发现，海参皂苷具有提高胰岛细胞的活性、降血糖的作用。

海参皂苷极性较大，易溶于极性较大的溶剂，并且海参内有较多磷脂类物质，因此一般采用醇提法，既去除脂肪酸，又节约成本。目前，对于海参皂苷的提取方法多为回流提取法[15]、醇-醇提取法[16]、水提取法[17]、冷浸提取法[18]，提取过程中均有糖和蛋白质的溶出，给后续纯化带来困难。本实验从料液比、乙醇浓度、提取温度三个方面考察不同条件对海参皂苷提取的影响，以及糖和蛋白质的获得情况，为海参皂苷的提取制备提供基础方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

海参：烟台本地市场购买的干海参，外壁呈深黑色，去离子水常温下浸泡24 h，搅碎分装(25±1 )g，低温保存。

香草醛、冰醋酸、浓硫酸等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ST16高速离心机(4000-40000转)，赛默飞世尔科技公司；HH-4S数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 皂苷的提取方法

取25 g海参，按照设定料液比加入乙醇溶液，恒温搅拌提取，每隔2 h取样，离心后测上清液中皂苷含量；每4 h测上清液中多糖和蛋白质含量。提取结束后，将提取液过滤离心，得到海参皂苷粗提液。

1.3.2 考察因素及水平

1)乙醇浓度：0%(纯水)、20%、40%、60%、80%；

2)温度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；

3)料液比(W/V)：1∶10、1∶15、1∶20。

1.4 测定方法

1.4.1 海参皂苷测定方法

参照香草醛-高氯酸显色体系[19]，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL(现用现配)，5 mL 60%(V/N)硫酸，混匀，60℃水浴反应20 min，室温放置10 min，以蒸馏水代替海参皂苷溶液作为空白参比，560 nm测定吸光度。按照上述方法绘制标准皂苷(Serva进口分装，北京希凯创新科技有限公司)标准曲线。标准曲线的回归方程为C=14.11A-0.000 5，其中R2=0.999 5，A为吸光度值，C为标准皂苷浓度(mg/mL)。计算提取液中皂苷提取率mg/g(干海参)。

1.4.2 多糖测定方法

采用苯酚-硫酸法[20]，葡萄糖为标准品。计算提取液中多糖提取率mg/g(干海参)。

1.4.3 蛋白质测定方法

采用考马斯亮蓝法[21]，牛血清蛋白为标准品。计算提取液中蛋白质提取率mg/g(干海参)。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对海参皂苷提取的影响

图1和图2是在20℃恒温条件下，5种浓度乙醇提取时提取液中海参皂苷、多糖、蛋白质含量的测定结果。

用40%、60%乙醇提取时，提取液中海参皂苷含量随提取时间变化较大，前4 h海参皂苷含量随提取时间持续增加至最高值，超过4 h，提取液中皂苷含量有较大程度下降(6 h)，并在6～10 h内保持较低值，这可能与在此提取过程中有大量多糖产生，而其与皂苷相互结合使皂苷沉淀析出有关，10 h后皂苷提取率略有增加；用20%、80%乙醇提取时，前4 h海参皂苷含量随时间增加，6～8 h时海参皂苷含量略有降低，之后随时间增长，海参皂苷含量有所上升；用0%乙醇(纯水)进行提取时，10 h之内，随着提取时间增加，提取液中海参皂苷含量逐渐增加，10 h后海参皂苷含量略有下降。

5种浓度乙醇的提取液中的多糖含量均随时间延长呈现先增加后下降的趋势，提取8 h时，提取液中多糖含量较高；60%、80%乙醇的提取液中多糖含量变化程度较大，又以80%乙醇提取液中多糖含量最高，0%、20%、40%乙醇的提取液中多糖含量变化幅度较小。

用20%、40%乙醇提取时，提取液中蛋白质含量随提取时间的延长略有增加；用80%乙醇提取时，提取液中蛋白质含量变化不大；60%乙醇提取8 h时，提取液中蛋白质含量显著低于4 h时，之后略微升高；用0%乙醇(纯水)提取时，提取液中蛋白质含量增加较多，提取结束时，蛋白质含量较多。

从上述结果可以看出，提取8 h时，皂苷提取较为完全，浓度为0%和80%的乙醇对海参皂苷的提取率较高；0%乙醇(纯水)提取液中多糖含量较少，蛋白质含量较高；80%乙醇提取液中多糖含量较高，蛋白质含量较少。由于蛋白质在后续分离过程中可以通过盐析、沉淀等方式比较方便地去除，而多糖则较难去除，因此选用0%乙醇(纯水)进行海参皂苷的提取。

2.2 温度对海参皂苷提取的影响

图3和图4是纯水在不同温度下对海参皂苷、多糖、蛋白质的提取结果。

不同温度提取时，随着时间的延长，海参皂苷提取率略有升高，8～10 h后，提取液中皂苷含量有所波动。不同提取温度比较，在实验设定的较高温度60℃下提取，皂苷得率较高。20℃、30℃、50℃提取12 h，提取液中皂苷含量显著高于最初提取(2 h)时。

20℃、30℃、40℃、50℃提取时，随着提取时间延长，提取液中的多糖含量呈现先上升再下降的趋势，其中40℃提取时变化幅度最大；60℃提取时，提取液中多糖含量随提取时间增加缓慢下降。5种温度下，20℃提取时提取液中多糖含量最低，60℃最高。

20℃提取时，提取液中蛋白质含量低于其他温度，随时间逐渐增加，8 h后趋于稳定；30℃和60℃提取时，提取液中蛋白质含量呈先减少后增加的趋势；40℃提取时，前8 h内提取液中蛋白质含量基本稳定，之后蛋白质含量逐渐降低；50℃提取时，提取液中蛋白质含量随提取时间缓慢增加。

从整体提取效果看，60℃提取时，皂苷得率最高，提取液中多糖和蛋白质含量也最多，后续除杂过程复杂，从海参中提取多糖的最佳提取温度也多为60℃[22]，大大增加了后续皂苷纯化难度；随着水浴温度上升，提取液中海参皂苷含量波动较大，这可能与皂苷的热不稳定性有关，因此，应注意在较高温度提取海参皂苷时，时间不宜过长，以免破坏皂苷结构；20℃、30℃提取时，提取液中皂苷含量明显上升，而20℃提取液中多糖、蛋白质含量低于30℃提取液，因此采用20℃提取，可以有效简化分离提纯步骤，节约成本。

2.3 料液比对海参皂苷提取的影响

图5和图6是用纯水在20℃提取时，3种料液比提取液中海参皂苷、多糖、蛋白质含量的测定结果。

提取过程中海参皂苷含量随提取时间增加而增加；3种料液比提取液中海参皂苷含量排序：1∶15提取液>1∶20提取液>1∶10提取液。这可能与料液比为1∶20时，提取液中多糖、蛋白质含量均较高，与提取所得皂苷结合后发生沉降，导致上清液中皂苷含量较低。

料液比为1∶10、1∶20时，提取液中多糖含量随时间延长先增加后降低，在8 h时达到最大值，料液比为1∶20时提取液中多糖含量下降更多；料液比为1∶15时，提取液中多糖含量随时间延长先降低后增加，在8 h时最低，这可能与提取出的某些碱性物质将多糖的糖链裂解有关。

料液比为1∶10时和1∶20时，8 h内提取液中蛋白质含量逐渐增加，之后略有下降；料液比为1∶15时，提取液中蛋白质含量随时间变化不大。

从上述结果可以看出，料液比为1∶15进行提取时，提取液中海参皂苷含量较高，而且提取过程中糖和蛋白质提出率较低。提取过程中，海参皂苷在8 h左右达到最高值，之后含量基本稳定，提取液中多糖和蛋白质含量在8 h时均较低，因此，提取时间可控制在8 h，既缩短了时间，也能保证得到皂苷含量高、杂质少的提取液。

3 结论

本实验采用搅拌提取法提取海参皂苷，针对影响提取率的乙醇浓度、温度、料液比设计提取实验，通过比较海参皂苷、多糖和蛋白质含量，选出了合适的海参皂苷提取条件。实验结果表明，提取海参皂苷时，用0%乙醇(纯水)、料液比为1∶15、20℃恒温进行提取，提取时间控制在8 h，可以有效提高海参皂苷得率，控制杂质产生，节约提取成本，简化分离提纯步骤。