APPL1在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究进展

赵 林，梁贵友

(1.遵义医科大学附属医院 心血管外科，贵州 遵义 563099；2.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025)

体外循环 (Cardio-pulmonary bypass，CPB) 是临床上心脏外科心内直视手术必需的技术手段，心肌缺血再灌注损伤 (Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI) 是CPB后发生严重心功能障碍甚至死亡的主要因素之一，其主要表现为再灌注后心肌舒缩功能障碍、心律失常及因心功能障碍而引起的各种并发症。当缺血心肌恢复灌注时，称为再灌注，该过程中发生的心肌损伤，这种现象称MIRI[1]。其发生机制目前主要有心肌细胞凋亡、钙超载、心肌胰岛素抵抗、氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)损伤等[2-7]。随着医学技术的不断提高，CPB术后心肌的保护措施不断完善，术后的并发症逐渐降低，但病死率仍然未达到临床所期，临床防治MIRI的效果仍需进一步提高。

APPL1 (Adaptor protein containing PH domain，PTB domain and Leucine zipper motif1) 是与脂联素受体1(AdipoR1)直接结合且重要的衔接蛋白，也是脂联素、脂联素信号传导通路中下游重要的传导介质， 脂联素诱导的AMPK途径必需将衔接蛋白APPL1与AdipoR1相结合后激活各种组织[8]。APPL1可以抑制心肌细胞凋亡、调节心肌的糖脂等能量代谢、增加胰岛素敏感性、减轻胰岛素抵抗的作用，而在心肌中发挥的这些作用可减轻MIRI[9-12]。因此，深入研究APPL1在缺血再灌注后心肌损伤中的保护作用显得尤为重要，APPL1或将成为MIRI预防及治疗的重要靶点。现就目前国内外文献有关APPL1在MIRI的作用及其机制作一综述。

1 APPL1的结构、分布及其生物活性特点

APPL1是Mitsuuchi在1999年发现的一种胞内结合蛋白，其人体的APPL1基因位于染色体3p14.3-21.1区，编码长度为709个氨基酸，APPL1有3个主要的功能区：Bar(Bin1 /amphiphysin/Rvs)结构域，Ptb(Phospho-tyrosine binding)结构域及Ph(Pleckstrin homology)结构域(见图1)[13]。它们主要参与转录抑制、凋亡以及分泌囊泡的融合、增强与GTP酶的结合、将蛋白锚定至特定的膜部位、衔接或支架的作用(见表1)。动物实验表明，APPL1的表达在心肌、脑、肝、骨骼肌、脂肪、肾脏等多种组织中都能检测得到[14-15]。

图1APPL1的结构

表1 APPL1的结构域及其作用

结构域主要作用BAR结构域感知和生成膜曲率、转录抑制、凋亡以及分泌囊泡的融合[15]PTB结构域在信号传导通路蛋白质结合过程中,发挥衔接或支架作用与AdipoR1/2结合,调节脂联素代谢[16]PH结构域与小GTP酶结合,在细胞内吞过程发挥作用[17]与BAR结构域相互作用,将蛋白锚定至特定的膜部位介导Reptin的核质穿梭,参与癌症的发生、发展[18]

2 APPL1通过抑制心肌细胞凋亡减轻MIRI

心血管外科体外循环术后MIRI过程中出现的心肌细胞凋亡也是加重MIRI的重要因素之一。ROS是诱发凋亡并引起缺血再灌注损伤的重要因素。MIRI主要通过三条途径产生氧自由基：黄嘌呤氧化酶途径、花生四烯酸代谢途径和线粒体呼吸链途径[19]，线粒体是MIRI中ROS 产生的主要场所[20]。ROS的大量堆积导致心肌细胞膜上的脂质发生过氧化，膜蛋白和酶的功能及活性也受损，进而导致心肌细胞的凋亡。李波等[21]研究发现，脂多糖(LPS)处理心肌细胞后，APPL1信使RNA和蛋白的表达水平均显著降低、心肌细胞活力降低，细胞凋亡率增加、细胞调亡蛋白酶-3蛋白水平升高；而 APPL1过表达的心肌细胞活力增高、细胞凋亡减少，且氧化损伤较轻、抗氧化酶能力强且ROS水平低，因此，APPL1 可以降低心肌细胞的氧化损伤，减少细胞凋亡，从而减轻MIRI。

在细胞实验中需要构建人体心肌细胞缺血再灌注的基本模型，目前主要是由H9C2细胞通过缺氧后再复氧(Hypoxia-reoxygenation，HR)来实现[22]。正是利用这种模型，Park等发现APPL1发挥着抗细胞凋亡的作用，尤其是通过球状脂联素(Globular Adiponectin，gAcrp)介导的信号转导通路：在由HR引起的细胞内ROS中，抑制脂联素受体(AdipoR1)的表达后，APPL1与AdipoR1的结合率降低，显著抑制了APN(Adiponectin，脂联素)预防HR诱导ROS生成的能力；gAcrp通过AdipoR1/APPL1信号传导阻止细胞凋亡途径并增加抗氧化能力； gAcrp可阻止缺氧/再氧合诱导的ROS产生及细胞凋亡蛋白酶-3的活化，而沉默APPL1基因后gAcrp的上述表现发生显著减弱[23]。更有几项实验表明了APN可以明显地减轻MIRI以及慢性冠脉综合征所诱导的细胞凋亡[24-28]。孙冬冬等[12]研究发现，APN可上调APPL1的表达，在心肌缺血再灌注损伤过程中起到抗凋亡的作用，并促进心肌细胞存活。由此可见，APPL1可通过APN抗心肌细胞凋亡在MIRI中发挥保护心肌细胞的重要作用。

3 APPL1通过改善心脏微血管内皮功能障碍减轻MIRI

心脏微血管的内皮细胞是构成心肌微循环的最基本的结构，它不仅可以分泌内皮素，调节微血管直径以控制组织循环流量，而且还可通过旁分泌和自分泌功能，调节心肌的生长发育、组织代谢、收缩功能以及节律控制，当发生心肌缺血再灌注损伤时，还可分泌NO，保护心肌细胞[29]；不仅如此，内皮细胞还表达AdipoR1，与脂联素直接结合，对胰岛素抵抗作用产生重要影响[30]。内皮素及NO主要由内皮细胞产生，内皮素的主要作用是收缩血管，而NO的主要作用是舒张血管，生理状态下，二者处于动态平衡，共同维持正常的内皮细胞功能[31]。血管内皮功能障碍表现为NO分泌减少，内皮依赖性血管舒张功能受损。血管通透性异常，血小板聚集，局部炎症反应，平滑肌增生及动脉粥样硬化等[32]。在体外循环心脏术后，发生的高血糖、高血脂刺激血管内皮时，NO释放减少或破坏增加而导致内皮功能紊乱，从而打破血管平衡稳态，最终导致一系列的心血管事件的发生，如心肌缺血再灌注损伤[31]。当心脏血流恢复时，在心肌细胞发生缺血再灌注损伤前，心脏微血管内皮细胞就已经受到了再灌注的损伤，也就是说，MIRI发生的第一步是心脏微血管内皮的损伤及功能障碍[33]。缺血和损伤的细胞释放大量的促炎介质，如白细胞介素、TNF-α等，使冠脉内皮细胞激活，激活的冠脉内皮细胞表面表达大量炎性黏附分子，介导白细胞的粘附反应和血小板的活化，从而加重心肌微循环障碍[34]。

心脏微血管内皮细胞表达AdipoR1，AdipoR1通过与脂联素结合后发挥作用[35]，脂联素对血管内皮的急性功能障碍与慢性结构损伤均有保护作用[36]。而离体实验表明，在血管内皮细胞中，脂联素可抑制由高糖、高脂所诱发的炎症效应，逆转血管内皮的慢性结构损伤[35,37]。上述提及，AdipoR1作为APPL1上游的直接结合物，在体外循环心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，且内皮功能障碍也是导致MIRI的重要原因，虽然目前国内外尚无文献报道APPL1与内皮功能障碍之间的直接关系，但我们可以推测，APPL1很可能通过改善心脏微血管内皮功能障碍，从而减轻MIRI。

4 APPL1通过调节糖、脂代谢减轻MIRI

脂联素(Adiponectin，APN)是一种改善胰岛素敏感性的增敏剂，其受体主要包括脂联素受体1(AdipoR1)、脂联素受体2(AdipoR2)及T-钙粘蛋白(T-Cadherin)，在心肌细胞中AdipoR1是APN的主要受体，APPL1是AdipoR1的关键结合蛋白[38]。位于APPL1功能区的PTB 结构域可与AdipoR1的胞内段直接结合[39]。多项实验研究发现，AdipoR1与APPL1相互作用，可介导APN 在多种细胞内的多条信号的转导途径(见图2)[38-41]。

图2 APPL1与AdipoR1及APN的关系

APN的降糖作用是通过抑制糖异生来发挥效应，具体包括以下几点：促进葡萄糖和脂肪酸的消耗、增加乳酸的生成和乙酰辅酶A羧化酶的磷酸化[42]。AdipoR1和APN结合后调节糖代谢，而过氧化物酶增殖物激活受体α(PPAR-α)和AMP活化后的蛋白激酶(AMPK)在这个过程发挥了重要的作用；AMPK是一种蛋白激酶，在能量代谢中如同传感器，高度依赖AMP发挥作用[43]。AMPK参与了β氧化及葡萄糖的摄取过程，通过影响APN受体下游的信号通路，也可导致胰岛素抵抗[44]。在心肌组织中，APN可通过降低甘油三酯的水平、消耗葡萄糖、脂肪酸和ATP来改善胰岛素的敏感性[9]。在PPAR-α信号通路中，APN上调下游蛋白乙酰辅酶A氧化酶和CD36的表达，加快了脂肪酸的转运，并调节糖代谢，进而减轻了胰岛素抵抗[10]。

本课题组研究也发现，CPB后心肌损伤严重及心脏舒缩功能发生障碍，但通过补充APN后，AMPK的表达及磷酸化增加，心肌葡萄糖摄取率增加，心肌细胞损伤减轻；相反，特异性的抑制了AMPK的活性，APN的上述功能也受到了抑制[11]。因此，我们认为APPL1可通过APN增加AMPK活性的作用，增加心肌胰岛素敏感性并减轻胰岛素抵抗，进一步促进心肌对葡萄糖的摄取，从而减轻MIRI。具体的机制作用仍需进一步探索。

5 展望

越来越多的证据表明APPL1对心肌具有保护作用，当体外循环术后，刺激内源性APPL1的表达可能成为减轻MIRI的预防及靶向治疗方向。细胞实验证明了APPL1在MIRI中通过发挥抗凋亡作用保护心肌细胞[24,26]；而且动物实验证明，APPL1的表达受到抑制后，APN减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用显著减弱，主要体现在心肌梗死面积的扩大及左心室射血分数的降低[45]。此外，APPL1在脂肪组织中还可以通过与HDAC3相互作用，缓解胰岛素抵抗[46]，但其与HDAC3在心肌中的胰岛素抵抗作用尚无相关研究。APPL1 在心力衰竭和糖尿病心肌病损伤中也发挥着重要的心肌保护作用[47-49]。但APPL1在人体心肌细胞中的作用，仍然有很多问题需要解决，主要有以下几个方面：① APPL1通过何种方式参与APN对AMPK的活化过程，怎样识别AdipoR1等机制并不清楚； ② 无论APPL1是在心肌能量代谢、胰岛素抵抗的作用，还是在抗心肌细胞凋亡中的作用，皆因其通过APN而发挥作用，是否APPL1还有其它途径来改善MIRI，目前国内外研究甚少；③ APPL1在MIRI中的作用及其机制，目前国内外的研究仍然停留在细胞和动物实验阶段，APPL1在人体内心肌缺血再灌注损伤中的表达及其作用并无相关研究。可见，想要更加细致的了解APPL1在人体心脏中的生物作用及其机制，并将其转化为预防及治疗MIRI的靶点，还有很长的路要走。随着在细胞、动物及人体中的研究不断的深入，APPL1或将成为防治MIRI潜在的药物作用的关键靶点，为心血管外科CPB术后并发症的临床治疗提供新的思路。