靶向抑制c-Myc表达与吉西他滨联合应用增强膀胱肿瘤细胞的化疗敏感性

卢 童，徐 康

(1.湖北省天门市第一人民医院 泌尿外科，湖北 天门 431700；2.武汉科技大学 职业危害识别与控制湖北省重点实验室，湖北 武汉 430081)

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]，其中以移行细胞癌最为常见。多数膀胱肿瘤患者需接受膀胱内灌注化疗，以期降低膀胱肿瘤复发机会。吉西他滨(Gemcitabine，Gem)是一类胞嘧啶核苷衍生物，主要作用于细胞周期的S期，通过干扰DNA复制发挥抗肿瘤效应，目前常用于膀胱灌注化疗[2-3]。但是在使用了一定治疗周期此类药物后，膀胱肿瘤细胞对其化疗敏感性会逐渐下降。c-Myc是Myc家族的重要成员，是一类重要的原癌基因，在多种肿瘤组织中呈高表达[4-6]，近期部分研究提示抑制c-Myc表达可提高胰腺癌和骨肉瘤等恶性肿瘤对化疗药物的敏感性[7-8]。基于上述研究背景，本研究拟采用小干扰RNA靶向下调c-Myc在膀胱肿瘤细胞中的表达，检测其与吉西他滨联合应用对化疗效果的影响，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 免疫组化 选取27例膀胱移行细胞癌组织及22例癌旁组织，按以下基本步骤行免疫组化检测：所有标本经固定包埋后制成5 μm切片，经脱蜡入水，阻断和抗原修复后，使用c-Myc一抗(CST公司)于1∶200浓度、4℃条件下孵育过夜，洗脱后，使用HRP标记的二抗(博士德生物公司)于1∶1 000浓度、室温条件下孵育20 min，随后显色并拍照，经图像分析系统检测获得c-Myc在各个组织中表达的平均光密度值。

1.2 小干扰RNA合成 本研究中针对c-Myc序列设计合成一组小干扰RNA(si-c-Myc)，正义链序列(5’-3’)：GGUCAGAGUCUGGAUCACC，反义链序列(5’-3’)：GGUGAUCCAGACUCUGACC。同时设计合成一组不结合任何人类基因组的阴性对照小RNA。本研究采用的小干扰RNA均由Thermo Fisher公司设计合成。

1.3 细胞培养及分组 本研究采用了人类膀胱移行细胞癌细胞株SW780，在含有10%血清的DMEM中培养，研究中将细胞分为5组：空白组不加入任何药物及小RNA，阴性对照组转染阴性对照小RNA，si-c-Myc组转染si-c-Myc，Gem组加入吉西他滨(江苏豪森公司)处理(药物终浓度0.05g/L)，si-c-Myc+Gem组转染si-c-Myc并加入吉西他滨处理(药物终浓度0.05g/L)。

1.4 小RNA转染 本研究采用了阳离子聚合物 INTERFER in vitro siRNA转染试剂盒(Polyplus公司)，按操作规程进行小RNA转染，转染过程中使用流式细胞术检测转染效率，其中阴性对照组、si-c-Myc组及si-c-Myc+Gem组的转染浓度均为25 nM。

1.5 流式细胞术凋亡率检测 将上述各组细胞经相应药物及小RNA转染处理48 h后，收获细胞并重悬，加入Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂(Beyotime公司)标记，随后将各组细胞置于流式细胞仪检测凋亡率。

1.6 Western blot免疫印迹检测 上述各组细胞经相应药物及小RNA转染处理48 h后，收获细胞并裂解获得蛋白后测定蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭等步骤处理，随后以一抗孵育过夜，经洗脱后再以辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，相应蛋白条带经显影后拍照。本研究中使用了以下一抗：anti-c-Myc抗体(CST公司)，anti- caspase 9 pro抗体(Abcam公司)、anti- caspase 3 pro抗体(Proteintech公司)、anti-Bcl-2抗体(Abcam公司)和anti-Bax抗体(Abcam公司)，内参使用anti-β-actin抗体(Santa Cruz公司)。

2 结果

2.1 c-Myc在膀胱肿瘤组织中呈高表达 免疫组化结果显示，c-Myc蛋白表达于细胞质或细胞核内，呈棕黄色颗粒样着色，如图1所示，c-Myc在膀胱移行细胞癌组织中的表达明显强于癌旁组织。图像分析系统检测光密度值显示，c-Myc在移行细胞癌组织中表达的平均光密度值为0.55±0.02，癌旁组织中表达的平均光密度值为0.22±0.01，两组间光密度值有明显差异(P<0.01)。

A: c-Myc在癌旁组织的表达；B：c-Myc在膀胱肿瘤组织的表达；×200。 图1 免疫组化法检测c-Myc在膀胱肿瘤组织及癌旁组织的表达

2.2 小干扰RNA si-c-Myc可有效抑制c-Myc在SW780细胞中的表达 经流式细胞术检测，小干扰RNA对SW780细胞的转染效率为(70.4±3.1)%。Western blot检测结果如图2所示，与未转染si-c-Myc的空白组和Gem组以及转染阴性对照小RNA的阴性对照组相比，经si-c-Myc转染处理48h后的si-c-Myc组和si-c-Myc+Gem组SW780细胞内c-Myc蛋白表达明显下调(P<0.05)。

2.3 联合应用si-c-Myc和吉西他滨可明显提高SW780细胞凋亡率 流式细胞术检测各组细胞凋亡率结果显示，空白组、阴性对照组、si-c-Myc组、Gem组、si-c-Myc+Gem组的SW780细胞凋亡率依次为：(5.41±0.52)%、(6.19±0.41)%、(12.88±0.86)%、(14.94±0.63)%、(30.38±1.06)%。如图3所示，si-c-Myc组和Gem组细胞凋亡率明显高于空白组和阴性对照组(P<0.01)，而si-c-Myc+Gem组的细胞凋亡率则明显高于si-c-Myc组和Gem组(P<0.01)。

*：与空白组、阴性对照组和Gem组相比，P<0.05。 图2 Western blot检测各组SW780细胞c-Myc蛋白的表达

图3 流式细胞术检测各组SW780细胞的凋亡率

2.4 联合应用si-c-Myc和吉西他滨可影响SW780细胞内凋亡相关蛋白的表达 如图4所示，与空白组和阴性对照组相比，si-c-Myc组和Gem组的SW780细胞内的caspase 9 pro蛋白、caspase 3 pro蛋白和Bcl-2蛋白的表达明显下调(P<0.05)，Bax蛋白表达则明显上调(P<0.05)。而与si-c-Myc组和Gem组相比，si-c-Myc+Gem组的caspase 9 pro蛋白、caspase 3 pro蛋白和Bcl-2蛋白的表达明显下调(P<0.05)，而Bax蛋白表达则明显上调(P<0.05)。

*：与空白组和阴性对照组相比，P<0.05；#：与si-c-Myc组和Gem组相比，P<0.05。图4 Western blot检测各组SW780细胞内凋亡相关蛋白的表达

3 讨论

作为膀胱肿瘤术后灌注化疗的常用药物，吉西他滨可在细胞周期过程中发挥特异性作用，将肿瘤细胞抑制并杀灭在DNA合成期(S期)，从而阻断肿瘤的进展[9-10]。作为一种具有多次复发倾向的肿瘤，膀胱肿瘤在接受多次灌注化疗后，对化疗药物的敏感性往往会逐渐下降，从而影响治疗效果。目前，肿瘤靶向治疗联合化疗药物是一类较为常见的应对化疗药物敏感降低的策略，而寻找合适的治疗靶点则成为目前膀胱肿瘤治疗的研究热点[11-12]。

作为MYC家族的成员，c-Myc是一种重要的原癌基因，可在多种人类肿瘤组织中过表达并发挥转录调节因子的作用：c-Myc基因定位于第8号染色体，其羧基端含有b-HLH-Zip结构域，可与Max的同类结构域相结合形成二聚体，此类二聚体可以与带有E盒的启动子相结合并启动相应基因的转录过程[13]。目前的多项研究显示，c-Myc在多种实体肿瘤中呈高表达，并有显著的促进肿瘤增殖或迁移的效应[14-15]。本研究中采用免疫组化方法检测了膀胱移行细胞癌和癌旁组织中的c-Myc表达，结果发现肿瘤组织中c-Myc蛋白的表达明显高于癌旁组织，提示c-Myc可能在膀胱肿瘤的发生发展过程中也起到重要作用。

近期的多项研究表明，c-Myc可作为一种重要的肿瘤治疗靶点[16-17]，靶向下调c-Myc表达或使用c-Myc抑制剂可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡[18-19]、抑制肿瘤增殖[20]或增强肿瘤细胞对化疗的敏感性[7-8]。为此，本研究中进一步针对c-Myc的mRNA序列合成了小干扰RNA si-c-Myc，并将其导入SW780膀胱肿瘤细胞内，结果表明此类小干扰RNA可有效的靶向性抑制c-Myc蛋白在膀胱肿瘤细胞内的表达。随后的研究中，联合应用si-c-Myc和吉西他滨干预SW780细胞，结果发现，与单独应用吉西他滨干预膀胱肿瘤细胞相比，将si-c-Myc与吉西他滨联合应用可进一步促进膀胱肿瘤细胞凋亡，这一结果表明靶向抑制c-Myc表达与吉西他滨联合应用可有效增强膀胱肿瘤细胞的化疗敏感性。

为进一步探讨联合应用si-c-Myc和吉西他滨诱导膀胱肿瘤细胞凋亡的可能机制，本研究中采用Western blot法检测了各组膀胱肿瘤细胞内凋亡相关蛋白的表达情况，结果显示，将si-c-Myc与吉西他滨联合应用明显放大了凋亡调控因子caspase 9蛋白的激活效应，并激活了重要的细胞凋亡效应蛋白caspase 3，同时进一步增强了下调Bcl-2及上调Bax表达的效应，引起Bcl-2/Bax比例更加明显的下调。由于Bcl-2/Bax比例的进一步下调可引起线粒体内膜的细胞色素C大量进入胞浆，与凋亡蛋白酶活化因子1单体结合形成凋亡体复合体[21]，从而导致膀胱肿瘤细胞凋亡水平的进一步上升，这可能是si-c-Myc与吉西他滨联合应用增强抗肿瘤效应的机制之一。

综上所述，c-Myc在膀胱肿瘤组织中呈高表达，si-c-Myc与吉西他滨联合应用可有效增强膀胱肿瘤细胞的化疗敏感性，此方法可以作为膀胱肿瘤治疗的一种新思路进一步加以研究和探索。