控制性超促排卵对小鼠胎盘功能的影响

姚琦，周阁，戴建国，张璐瑶，胡荣魁

1南京中医药大学病理学与病理生理学系，南京 210023；2南京中医药大学附属医院生殖科，南京 210023；3南京中医药大学附属医院妇科，南京 210023

自1988年我国首例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术(assisted reproductive technologies，ART)子代正逐渐成为我国新生人口的一个重要组成部分[1]。大量流行病学数据显示，ART的核心技术——控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)引发的母体孕早期超生理的激素水平与胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)及低出生体重密切相关[2-5]。Hu等[4]的一项回顾性队列研究显示，鲜胚移植子代的出生体重较冻胚移植子代、自然妊娠子代明显降低，且鲜胚移植子代低出生体重儿、小于胎龄儿的发生率较冻胚移植子代、自然妊娠子代明显增高。进一步分析发现，在鲜胚移植单胎妊娠组，因COH引发的母体孕早期雌激素水平越高，子代发生低出生体重儿、小于胎龄儿的风险就越高。Farhi等[2]也发现，COH引发的母体孕早期雌激素水平越高，子代发生宫内发育迟缓的风险越高。但COH引发的母体孕早期超生理激素水平影响胚胎生长发育的病理学机制目前尚不清楚。

妊娠期胎盘是联系母体与胎儿的枢纽，胎儿在子宫内能否正常生长发育取决于胎盘的功能，而目前仍不清楚COH引发的母体高激素水平是否会影响胎盘功能。因此，本研究通过建立COH引发母体孕早期高激素水平的小鼠模型，观察孕18.5 d时的胚胎重量、胎盘重量及胎盘功能，探讨COH影响小鼠胎盘功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 SPF级7～8周龄雌性昆明小鼠150只，体重26～32 g；8～10周龄雄性昆明小鼠40只，体重32～40 g，购自上海杰思捷实验动物技术有限公司[许可证号SCXK(沪)2013-0006]。人输卵管液(HTF)、简单优化培养液(KSOM)胚胎培养液(日本ARK-Resource公司)；人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波第二激素厂)；TUNEL检测试剂盒(德国Roche公司)；SNAT2抗体(美国Abcam公司)；β-actin抗体及二抗(美国Santa Cruz公司)；生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。实验过程符合国家及单位有关实验动物的管理及使用规定。

1.2 方法

1.2.1 结扎雄性小鼠输精管 取10只10周龄雄性小鼠，0.8%戊巴比妥钠麻醉，轻压腹腔，将两侧睾丸压回阴囊，沿左侧阴囊中线做一长约10 mm切口，在睾丸胞膜上做一长约5 mm切口，将输精管牵引出来，将其烧烙掉1 cm左右，缝合手术切口。重复上述步骤处理另一侧睾丸及输精管。

1.2.2 体外受精(in vitrofertilization，IVF) 取供卵鼠20只，腹腔注射PMSG 10 U/只，46 h后腹腔注射HCG 10 U/只。13 h后，取卵丘复合物，加入获能精子，置于HTF胚胎培养液中受精4～6 h，将受精卵移入KSOM胚胎培养液中培养至囊胚。

1.2.3 假孕雌鼠的制备及胚胎移植 将性成熟雌性小鼠与输精管结扎术后的雄性小鼠按2:1合笼，次日上午检查雌鼠，见阴道栓者为假孕雌鼠，计为孕0.5 d。以此假孕雌鼠作为囊胚移植的受体鼠为自然交配假孕鼠(自然交配受体组)。将性成熟雌性小鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，46 h后腹腔注射HCG 10 U/只，与输精管结扎后的雄性小鼠合笼，次日上午检查雌鼠，见阴道栓者为假孕雌鼠，计为孕0.5 d。以此假孕鼠作为囊胚移植的受体鼠为超促排后交配假孕鼠(超促排受体组)。以上两组均在孕2.5 d于左侧子宫角移植8～10枚囊胚(图1)。

1.2.4 胎盘组织学分析 于孕18.5 d选取自然交配受体组、超促排受体组各6窝胎鼠中最接近平均体重胎鼠的胎盘，4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察胎盘组织病理学改变情况，辨别胎盘迷路层及连接层，用显微图像软件cellSens software (version 1.8)测量胎盘迷路层及连接层 面积。

1.2.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测胎盘细胞凋亡情况 胎盘组织石蜡切片脱蜡、水合，细胞通透，滴加TUNEL检测液37 ℃孵育60 min，3%H2O2阻断内源性过氧化氢酶，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体37 ℃孵育30 min，DAB显色。显微镜观察，分别计数胎盘迷路层、胎盘连接层1300个细胞中的凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/1300×100%。

图1 IVF、胚胎移植、胚胎及胎盘收集流程图Fig.1 Flow chart of IVF, embryo transplantation, collection of fetuses and placenta

1.2.6 胎盘组织中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量测定 于孕18.5 d选取自然交配受体组、超促排受体组各6窝胎鼠中最接近平均体重胎鼠的胎盘，于PBS中制备10%胎盘组织匀浆，取上清，巴比妥酸法测定胎盘组织中的MDA含量，分光光度计法测定胎盘组织中的GSH含量，Bradford法测定细胞蛋白浓度。操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.7 荧光实时定量PCR检测胎盘Snat1、Snat2、Snat4、Lat1、Lat2、Cd98、Taut mRNA水平 于孕18.5 d选取自然交配受体组、超促排受体组各3窝胎鼠中最接近平均体重的3只胎鼠的胎盘，Trizol试剂提取各组胎盘组织的总RNA，取4 μg RNA反转录为cDNA，采用Applied Biosystems StepOnePlusTM荧光实时定量PCR仪进行PCR扩增，各引物见表1。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，35个循环。检测荧光信号并分析循环阈值(Ct)，ΔCt为目的基因与内参照GAPDH循环阈值的差值，ΔΔCt为超促排受体组与自然交配受体组ΔCt的差值，采用公式2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.2.8 胎盘微绒毛膜(microvillous membrane，MVM)提取 于孕18.5 d分别将自然交配受体组、超促排受体组各6窝胎鼠的胎盘合并，于BufferA(含250 mmol/L蔗糖，1 mmol/L乙二胺四乙酸，10 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸-三异丙基乙磺酰，蛋白酶抑制剂混合物，pH值7.4)中匀浆。取上清，参照Jansson等[6]报道的Mg2+沉淀法通过差速离心提取胎盘MVM。

表1 荧光实时定量PCR引物Tab.1 Primers used for real-time PCR

1.2.9 Western blotting检测MVM中SNAT2蛋白水平 蛋白煮沸变性后，用10% SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST室温封闭2 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，用化学发光试剂ECL A液及B液检测，IS2000R图像工作站成像。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。所有计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组的窝数、胚胎数、胚胎及胎盘重量比较 孕18.5 d，6只自然交配受体获得37枚胚胎，6只超促排受体获得29枚胚胎，胚胎均在左侧子宫角获得，提示胚胎均通过移植获得。超促排受体组每窝胚胎数、胚胎重量及胎盘重量均低于自然交配受体组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.2 两组胎盘迷路层、连接层面积及细胞凋亡情况比较 两组的胎盘未见明显病理学改变(图2)。两组的胎盘迷路层面积、连接层面积、胎盘迷路层面积/总面积比值、胎盘连接层面积/总面积比值差异均无统计学意义(P>0.05)。超促排受体组胎盘迷路层及连接层的细胞凋亡率均明显高于自然交配受体组，差异有统计学意义(P<0.05，图3、表3)。

2.3 两组胎盘组织中GSH、DMA含量比较 与自然交配受体组比较，超促排受体组胎盘组织中抗氧化物质GSH含量明显降低，脂质过氧化产物MDA含量明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05，表4)。2.4 两组胎盘氨基酸转运体表达水平比较 与自然交配受体组(1.00±0.00)相比，超促排受体组的氨基酸转运体Snat1、Snat2、Lat2、Taut mRNA表达水平明显降低(分别为0.77±0.13、0.65±0.18、0.69±0.18、0.73±0.07)，差异有统计学意义(t分别为5.45、6.30、5.08、11.64，P<0.001)。

表2 两组受孕小鼠胚胎数、胚胎及胎盘重量比较 (x±s)Tab.2 Comparison of litter size, fetal and placental weight between the mice in two groups SOP group and NSP group (x±s)

图2 两组受孕小鼠孕18.5 d的胎盘迷路层(L)及连接层(J) (HE染色，×40)Fig.2 Placental labyrinth layer (L) and junction layer (J) at E18.5 d in the mice of two groups (HE staining, ×40)

2.5 两组胎盘MVM中SNAT2蛋白含量比较 Western blotting检测结果显示，超促排受体组MVM中的SNAT2蛋白含量(0.32±0.01)明显低于自然交配受体组(0.65±0.15)，差异有统计学意义(t=4.29，P<0.001，图4)。

3 讨 论

本研究结果显示，与自然交配受体组比较，超促排受体组孕18.5 d的胚胎及胎盘重量明显减轻，胎盘组织结构未见明显病理学改变，但胎盘组织中GSH含量明显减少，MDA含量明显增多，说明超促排受体组胎盘处于氧化应激状态。有研究发现，人为增加狒狒孕早期雌激素水平，可致滋养层入侵蜕膜、子宫动脉重构受损，胎盘血供不足，胎盘组织处于缺氧状态[7-8]，而胎盘组织缺血缺氧易导致线粒体功能障碍，产生大量自由基，胎盘氧化-抗氧化平衡状态失调，从而使胎盘处于氧化应激状态。

图3 两组孕18.5 d胎盘迷路层及连接层的细胞凋亡情况 (TUNEL, ×400)Fig.3 Apoptosis of placental labyrinth layer and junction layer at E18.5 d (TUNEL, ×400)

表3 两组受孕小鼠胎盘迷路层、连接层面积及细胞凋亡率比较 (x±s, n=6)Tab.3 Comparison of the areas and apoptosis rates of placental labyrinth layer and junction layer between the mice in two groups (x±s, n=6)

表4 两组受孕小鼠胎盘组织中GSH、MDA含量比较 (x±s, n=6)Tab.4 Contents of GSH and MDA in placental homogenates of mice in SOP group and NSP group (x±s, n=6)

图4 两组受孕小鼠胎盘组织中SNAT2蛋白的表达水平(Western blotting)Fig.4 Expression levels of Snat2 and β-actin protein in placental MVM of mice in SOP group and NSP group (Western blotting)

研究显示，氧化应激可引发胎盘组织细胞凋亡，并影响胎盘营养物质氨基酸的转运[9-11]。本研究采用TUNEL技术检测了胎盘组织细胞的凋亡情况，发现超促排受体组胎盘组织细胞凋亡率明显高于自然交配受体组。胎盘氨基酸转运体分为三大类：A型Na+依赖性氨基酸转运体，介导非必需中性氨基酸的摄取，如丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸；L型Na+非依赖性氨基酸转运体，介导必需中性氨基酸的摄取，如亮氨酸；β型Na+依赖性氨基酸转运体，介导牛磺酸的摄取。A型Na+依赖性氨基酸转运体主要包括Snat1(SLC38A1)、Snat2(SLC38A2)及Snat4(SLC38A4)。L型Na+非依赖性氨基酸转运体由轻链及重链构成，轻链为Lat1(SLC7A5)、Lat2(SLC7A8)，重链为4F2hc/Cd98(SLC3A2)。β型Na+依赖性氨基酸转运体为牛磺酸转运体(taurine transporter，Taut)[12]。本研究采用荧光实时定量PCR检测了胎盘组织氨基酸转运体Snat1、Snat2、Snat4、Lat1、Lat2、Cd98、Taut mRNA水平，发现超促排受体组的Snat1、Snat2、Lat2、Taut mRNA表达明显降低，其中Snat2 mRNA下降最明显。

氨基酸自母体转运至胎儿，需跨越靠近母体血液循环的MVM、靠近胚胎毛细血管的基底膜(BM)及胚胎毛细血管内皮。氨基酸跨越胎盘MVM、BM由膜上的氨基酸转运体介导，跨越胚胎毛细血管内皮较容易，只需通过毛细血管内皮细胞的缝隙。因此，胎盘MVM是氨基酸自母血转运至胚胎的首过限速屏障，其关键取决于MVM氨基酸转运体的表达。研究显示，妊娠合并宫内发育迟缓时，胎盘MVM氨基酸转运体表达下调，氨基酸转运体活性明显降低[12]。本研究发现，超促排受体组的胎盘MVM氨基酸转运体Snat2蛋白表达较自然交配受体组明显降低。笔者推测其可能的机制为：COH引发小鼠胎盘氧化应激，胎盘组织凋亡细胞异常增加，胎盘MVM氨基酸转运体表达下调，胚胎摄取氨基酸受限，进而导致胚胎生长发育迟缓。但COH引发的胎盘氧化应激具体通过何种信号通路导致胎盘组织细胞凋亡及氨基酸转运体表达下调，尚有待于进一步研究。