天麻破壁粉、冻干粉对戊四唑诱导癫痫大鼠海马组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAT-1 mRNA及蛋白表达对比研究＊

刘春艳，柴艺汇，田兴中，唐靖雯，卢礼平，谢 宇，5，周 雯，牛建均，陈露露，张丽艳＊＊，茅向军

（1.贵州中医药大学 贵阳 550025；2.贵州威门药业股份有限公司 贵阳 550018；3.贵州省食品药品检验所 贵阳 550004；4.张家口市第五医院 张家口 075000；5.贵州广济堂药业有限公司贵阳 550014）

癫痫（epilepsy，EP）是指神经元放电异常导致短暂性脑神经系统功能紊乱的一种疾病[1]。研究发现[2]，癫痫持续性发作改变了脑内的神经递质、酶、氨基酸等物质的发生，导致脑细胞损害，甚至神经细胞凋亡。癫痫发作中有很多基因被诱导表达，其中包括抑制基因Bcl-2和促进基因Bax、Caspase3，这些基因编码的蛋白质产物参与凋亡的调控[3]。癫痫等神经系统类疾病均与脑内γ-氨基丁酸（GABA）浓度有关，关于GAT-1主要工作是迅速摄取细胞和突触间隙外液的GABA，结束了GABA的突触传递过程。所以GAT的降低能减少GABA的清除，从而增强了GABA的抑制作用，减少惊厥发生的机率[4]。天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，具有平抑肝阳，息风止痉，祛风通络等功效[5]。天麻的加工方式主要以传统炮制为主，存在保存困难，品质不均，有效成分利用率低的缺点。为解决这一问题，提出了中药破壁粉碎和真空冷冻干燥概念和相关技术，破壁粉碎技术提高了中药的生物利用度，保留传统中药饮片的化学成分、中药性能及配伍等传统属性[6]。冷冻干燥技术主要解决了天麻新鲜药材无法长期保鲜的难题，同时保证药材生物活性完整、药剂定量准确、脱水彻底、易复水再生等优点[7]。目前天麻破壁粉和冻干粉现有药效学研究基础还较薄弱，本课题初步探讨不同加工方式的天麻对神经保护作用的差异，旨在为后期天麻破壁粉和冻干粉安全性隐患和有效剂量的探索提供研究依据，对保障天麻破壁粉和冻干粉的质量及药用资源的节约具有重要的意义。

1 材料

1.1 动物

健康SD大鼠72只，体重约（200±20）g，雌雄各半，动物许可证号：SCXK（军）2012-0011，购自于庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司。

1.2 试剂

戊四唑（美国Alfa公司，批号：#L16185）；丙戊酸钠（赛诺菲（杭州）制药有限公司，批号：6HG0478）；TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP405-02）；Ultrapure RNA Kit（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0581M）；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：Q221-01）；BCA蛋白定量试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0014Slot 40326）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（康为世纪生物科技 有 限 公 司，批 号：CW0591S lot 30330）；Wester blotting ladder pen（康为世纪生物科技有限公司，批号：CW2502）；ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0049mLOT 30330）；抗β-Actin鼠单克隆抗体（康为世纪生物科技有限公司，批号：Cw0096m lot 40241）；抗β-Actin兔多克隆抗体（康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0097A）；Bcl-2抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，批号：RLM 3041）；caspase-3抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，批号：RLT 0656）；Bax抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，批号：RLT 0456）。

1.3 仪器

荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ABI7500）；板式酶标仪（北京新风机电公司，型号：ZS-2）；电泳仪（伯乐生命医学产品有限公司，型号：164-5050）；蛋白电泳槽（伯乐生命医学产品有限公司，型号：Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System）；蛋白转印系统（伯乐生命医学产品有限公司，型号：Mini Trans-Blot）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号：Tanon 1600）。

1.4 药物

本品来源于贵州大方地区自采，药材经贵州中医药大学植物栽培教研室魏升华教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎。普通粉：60℃烘干，粉碎过6号筛；破壁粉：60℃烘干，经破壁粉碎加工、干压制粒而成；冻干粉：新鲜天麻切制，灭菌，再用真空干燥机冻干，过药典小钢磨粉碎后过6号筛。

2 方法

2.1 动物分组和给药

72只健康成年SD大鼠，实验动物适应性喂养7 d后，随机分为12组，每组6只，然后标记、称重。分组，正常组：给予生理盐水4 mL·kg-1灌胃，模型组：戊四唑（PTZ）腹腔内注射0.08 g·kg-1前给予生理盐水（4 mL·kg-1）灌胃，连续10 d。阳性对照组：戊四唑（PTZ）腹腔内注射0.08 g·kg-1后，给予丙戊酸钠（VPA）0.12 g·kg-1灌胃，连续10 d，给药组：PTZ腹腔内注射0.08 g∕kg后，给予天麻（普通粉、破壁粉、冻干粉）低、中、高剂量组（0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1），药物均匀溶解，连续灌胃10 d。

2.2 动物模型的建立

造模给药后，判断癫痫发作强度，采用7点评分法：0级：没有行为上的发作；Ⅰ级：节律性点头或头部颤搐；Ⅱ级：阵挛性咀嚼；Ⅲ级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级：袋鼠姿势（上身直立）；Ⅴ级：跌倒；Ⅵ级全身强直阵挛性惊厥。记录发作潜伏期（从腹腔注射PTZ到出现上述症状的时间，以秒为单位）；发作持续时间（从上述症状开始发作到终止的时间，以秒为单位）。

2.3 检测指标

2.3.1 RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1 mRNA表达水平

把海马组织研磨成粉末状后，采用TRNzol总RNA提取试剂提取样本RNA，按产品说明书进行实验。然后采用分光光度计测定总的RNA浓度，根据光度计260 nm∕280 nm 1.80-2.10处的比值测定其纯度，并进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA片段完整性。根据cRNA反转录试剂盒要求，取总RNA 10μL进行逆转录，采用以下条件进行PCR反应：95℃，30 s；40个PCR循环（95℃，5 s；60℃，40 s（收集荧光））。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，（95℃，10 s；60℃，60s；95℃，15 s）；并从60℃缓慢加热到99℃。分别用目的基因引物和以GAPDH作为内参基因，引物序列为GAPDH上游引物序列5'-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3'，下游引物序列5'-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3'，扩增产物长度270 bp；Bax上游引物序列5'-GGTGGTTGCCCTTTTCTACTTTGC-3'，下游引物序列5'-GCTCCCGGAGGAAGTCCAGTG-3'，扩增产物长度113 bp；Bcl-2上游引物序列5'-GGGCTACGAGTGGGATACTGGAG-3'，下游引物序列5'-CGGGCGTTCGGTTGCTCT-3'，扩增产物长度101 bp，Caspase-3上游引物序列5'-ACTGGAAAGCCGAAACTCTTCATCA-3'，下游引物序列5'-GGAAGTCGGCCTCCACTGGTATC-3'，扩增产物长度127 bp，GAT-1上游引物序列5'-TGGAACACTGACCGCTGCTT-3'，下游引物序列5'-GAATCAGACAGCTTTCGGAAGTTGG，扩增产物长度343 bp。所有反应均设立3个复孔。记录每个反应管中标本的Ct值，据RT-PCR原始数据Ct值，计算相对定量值。

2.3.2 Western blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1蛋白表达水平

称取海马组织加入适量RIPA（细胞裂解液）提取液提取蛋白，10 000 rpm离心20 min，收集上清，再按细胞蛋白提取试剂盒说明进行蛋白提取，检测蛋白浓度。将制备好的蛋白样品加入12%的凝胶中电泳，转膜，取膜。一步法快速WB试剂盒将其加入封闭液中，保持20 min，用蒸馏水将一步法试剂盒中的10×洗液稀释为1×洗液；将二抗HRP放入离心管，使一抗与二抗充分混匀，于室温条件下孵育5 min，再加入一步法抗体稀释液（一抗Bcl-2浓度（1:500）、二抗Bcl-2浓度（1:200）、一抗Bax浓度（1:1 000）、二抗Bax浓度（1:200）、一抗caspase3浓度（1:500）、二抗caspase3浓度（1:200）、一抗GAT-1浓度（1:1 000）、二抗GAT-1浓度（1:200）、一抗内参β-actin浓度（1:5 000）、二抗内参βactin浓度（1:200））。漂洗去掉抗体混合液，洗液清洗3次，每次用5 mL洗液漂洗5 min。在反应盒内加入高灵敏度化学发光检测试剂盒A液及B液各1 mL，混匀，放入PVDF膜，使膜表面与试剂充分接触5 min，放于凝胶成像仪中，选择化学发光，开始曝光。照相并保存，用化学发光凝胶成像系统软件进行图像分析，采用目的蛋白与内参的比值来表示蛋白表达水平。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 天麻普通粉，冻干粉，破壁粉癫痫发生强度和时间比较

模型组癫痫发作强度为Ⅵ级，阳性药对照组癫痫发作强度为Ⅴ级，天麻普通粉、天麻破壁粉各剂量组惊厥发作强度介于Ⅴ-Ⅵ级，天麻冻干粉各剂量组癫痫发作强度介于Ⅳ-Ⅵ级。模型组癫痫潜伏时间短、持续时间长，发作强度均为Ⅵ级，表明造模成功。与模型组比较，丙戊酸钠组及天麻普通粉、破壁粉、冻干粉各剂量组癫痫潜伏时间显著延长（P＜0.05），癫痫持续时间显著缩短（P＜0.05）。与丙戊酸钠组比较，天麻普通粉高剂量组、天麻破壁粉高剂量组癫痫潜伏时间无显著差异，天麻冻干粉高剂量组癫痫潜伏时间显著延长（P＜0.05）；天麻冻干粉高剂量组癫痫持续时间无显著性差异（P＞0.05）。

3.2 RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1

mRNA表达水平

表1 天麻（普通粉，冻干粉，破壁粉）抗癫痫发生时间比较（±s,n=6）

表1 天麻（普通粉，冻干粉，破壁粉）抗癫痫发生时间比较（±s,n=6）

注：与正常组（Control）比较a P＜0.05；与模型组（Model）比较b P＜0.05；与阳性对照组比较c P＜0.05。天麻普通粉低(A1)、中(A2)、高(A3)剂量组；天麻破壁粉低(B1)、中(B2)、高(B3)剂量；天麻冻干粉低(C1)、中(C2)、高(C3)剂量组；阳性组：VPA丙戊酸钠组。

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与正常组比较，模型组Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相对表达量显著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA相对表达量显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，丙戊酸钠组和天麻各组可显著降低Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相对表达量（P＜0.05），显著升高Bcl-2、mRNA相对表达量（P＜0.05），天麻冻干粉高剂量组调节Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1 mRNA表达量效果最佳，天麻破壁粉高剂量组次之，最后为天麻普通粉高剂量组。均可在不同程度改善Bax、Caspase-3、Bcl-2和GAT-1 mRNA相对表达量，在一定程度上呈量效关系。

3.2 Western blot法 检 测Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1蛋白表达水平

与正常组比较，模型组Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白相对表达量显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，丙戊酸钠组可显著降低Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相对表达量（P＜0.05），显著升高Bcl-2蛋白相对表达量（P＜0.05）。天麻普通粉、破壁粉及冻干粉各剂量组均可显著降低Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相对表达量（P＜0.05），显著升高Bcl-2蛋白相对表达量（P＜0.05），且药效与剂量在一定程度上呈正相关，其中，冻干粉高剂量组Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相对表达量与丙戊酸钠组无显著差异（P＞0.05），冻干粉中剂量组Bcl-2蛋白相对表达量与丙戊酸钠组无显著差异（P＞0.05），冻干粉高剂量组Bcl-2蛋白相对表达量显著高于阳性对照组（P＜0.05）。

4 讨论

《本草纲目》云：“天麻，为治风之神药，乃肝经气分之药[8]。临床可以用于肢体麻木、头痛、破伤风、惊厥、癫痫等。研究表明，癫痫的发作与神经细胞的发生有密切的关系，导致的神经元损伤主要源于细胞的凋亡和坏死[9]。Bcl-2是最主要的抑制细胞凋亡基因，癫痫可导致Bcl-2家族的表达变化；当细胞增殖活性受到损伤或凋亡时，Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，心肌细胞线粒体膜通透性升高，活化细胞凋亡分子Caspase-3，导致细胞凋亡[10]。研究表明，天麻素能增加大鼠癫痫发作时大脑皮质神经元抗凋亡蛋白Bcl-2和降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达，抑制癫痫凋亡的发生，从而发挥保护神经细胞作用[11]。中药治疗癫痫的机制主要是对神经递质的调节作用，GAT是一种主要位于神经元及胶质膜上的糖蛋白，属于Na+∕Cl-转运蛋白家族，其亚型有GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4∕BGT1和TAUT，GAT-1是脑组织内最重要GATs，在GABA递质的转运过程中起关键作用[12]。GAT-1表达的异常会导致GABA能神经信号传递的变化，GAT-1通过影响GABA神经元，在神经递质的平衡中起重要作用进而导致多种神经系统疾病。毛小元[13]等检测癫痫大鼠海马GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白的表达，结果显示，癫痫大鼠海马GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白的表达均高于正常组，癫痫大鼠海马内GAT-1和GAT-3表达上调可能促进了癫痫的发生。

表2 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bcl-2、Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA表达的影响（±s,n=6）

表2 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bcl-2、Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA表达的影响（±s,n=6）

注：与正常组（Control）比较a P＜0.05；与模型组（Model）比较b P＜0.05；与阳性对照组比较c P＜0.05

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图1 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bax蛋白相对表达量

图2 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bax蛋白相关表达蛋白水平影响条带图

图3 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bcl-2蛋白相对表达量

图4 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Bcl-2蛋白相关表达蛋白水平影响条带图

中药产生的药效不只由药物特有的化学成分所决定，还可能与药物的物理化学状态等因素密切相关。因此，改变药物物理状态是提高药物药效及研发新型药物的一种值得探讨的方法，中药破壁粉是运用超微粉碎技术将传统饮片进行细胞级微粉碎并制粒成D90＜45μm的粉体的第4代新型中药饮片[14]。黄艺蓉等[15]以三七破壁饮片及其普通饮片作为研究对象，比较两者对家兔凝血作用的影响，结果显示三七破壁饮片的作用强于普通饮片。冷冻干燥是在低温下对药物进行冷冻，在高真空下将药物水分直接升华而除去的干燥方法[16]。在国内中药的冷冻干燥工艺研究没有广泛开展起来，鲜天麻冻干粉的研究报道较少。研究表明[17-18]，采用真空冷冻干燥法加工的天麻中天麻素的含量高于传统方法的水煮、烘干法。

图5 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Caspase3蛋白相对表达量

图6 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织Caspase3蛋白相关表达蛋白水平影响条带图

图7 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织GAT-1蛋白相对表达量

图8 不同天麻组对戊四唑诱导癫痫海马组织GAT-1蛋白相关表达蛋白水平影响条带图

本课题组前期实验研究证明，三者的化学成分有明显差异，可见天麻不同的干燥方式和不同的粉碎方式对其化学成分具有一定的影响，但天麻有效成分含量是否有差异，待进一步的研究。因此本实验从药理实验显示，与正常组比较，模型组Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相对表达量显著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量显著下降P＜0.05），癫痫发作后bcl-2基因的表达减少，Bax、Caspase3基因表达增加，可能使钙超载、神经纤维生长因子和氧自由基增加导致了神经细胞凋亡。癫痫发作后GAT-1上调可摄取胞浆内的GABA，起到下调GABA的作用。本研究表明，天麻各组均可在不同程度改善Bax、Caspase-3、Bcl-2和GAT-1 mRNA及蛋白相对表达量，在一定程度上呈量效关系，天麻破壁粉和冻干粉都能抗细胞凋亡，下调GAT-1表达，其中冻干粉高剂量组效果最佳，且作用效果都明显优于普通粉。其药效的提高可能与不同的干燥方式和不同的粉碎方式造成有效物质的溶出率不同有关，其研究结果为天麻的破壁粉和冻干粉的临床应用提供了一定的理论依据和实验基础。综上所述，本研究表明其作用机制可能是天麻能够上调神经元Bcl-2表达、下调Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA及蛋白表达水平有关，但天麻冻干粉和破壁粉如何调控凋亡因子及其信号通路机制尚未清楚，且癫痫发病机制复杂，其他神经递质及因素可能也会对其产生影响有待进一步深入研究。