乳香与醋乳香对溃疡性结肠炎大鼠抗炎作用的对比研究＊

梁东蕊，宋志前，宁张弛，王 淳，马新玲，万晓莹，刘振丽

（中国中医科学院中医基础理论研究所 北京 100700）

乳香来源于橄榄科植物乳香树Boswellia carterii Birdw.及同属植物Boswellia bhaw-dajiana Birdw.树皮渗出的树脂，主治胃脘疼痛，癥瘕腹痛，痈肿疮疡[1-2]。始载于《名医别录》，具有活血行气化瘀、消肿止痛的功效[2]。国外临床研究显示，乳香醇制剂对溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）有很好的疗效，80%患者服用后病情得到缓解[3]，其对慢性结肠炎II级和III级患者有效率分别为100%和60%[4]。UC是炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease，IBD）的一种，病变范围广泛[5]。中医学将其归属于“肠澼”、“泄泻”及“痢疾”等范畴，采用“清热利湿、化瘀行气、涩肠解毒”为主要治法[6]。认为针对其“气滞血瘀而发病”的特点，可以运用乳香活血行气的功效加以治疗[7]。中医临床治疗多以其炮制品醋乳香入药[8-9]。乳香醋炙可降低刺激性，并增强活血行气化瘀、消肿止痛功效[1]。由角叉菜胶诱导的大鼠胸腔白细胞游走抑制实验也表明，乳香醋炙后抗炎作用显著增强[10]。那么，醋乳香对UC模型动物是否有作用，以及醋炙前后作用是否存在差异，还未见研究报道。

UC常用的实验动物模型制作方法主要有化学刺激法、免疫法和复合法三大类。TNBS∕乙醇作为常用的复合法，制作简单、价格低廉且具有较好的重复性，通过单剂灌肠诱导，不需要预先致敏或对动物进行外科手术，模型持续时间较长，模型组织学变化与人类结肠炎相似，是评价药物疗效稳定的结肠炎模型[11]。因此本文拟采用TNBS∕乙醇诱导大鼠UC模型，通过比较大鼠的DAI、CMDI、结肠HS评分以及肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）的水平，探究醋乳香对UC功效及醋炙前后的作用差异，为乳香醋炙理论提供科学基础，并为临床提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，体重（250±20）g，北京维通利华实验动物中心提供，实验动物在中国中医科学院中医基础理论研究所SPF级动物房喂养[实验动物室许可证号SYXK（京）2016-0021]。

1.2 饮片、药品及试剂

乳香购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，均为橄榄科植物乳香树Boswellia carterii Birdw.树皮渗出的树脂。TNBS(批号SP229701，Sigma），水合氯醛（批号20180420，天津福晨化学试剂厂），柳氮磺吡啶肠溶片（Salazosulfapyridine，SASP）（0.25 g∕片，批号20180106，上海信谊嘉华药业有限公司生产），羧甲基纤维素钠（Sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na，批 号20161025，上海沪试），0.9%氯化钠注射液（批号1709283205，石家庄四药有限公司），95%乙醇（批号20160504，北京化工厂），甲醛溶液（批号20180420，天津福晨化学试剂有限公司），注射器（批号20130821，山东威高集团医用高分子制品股份有限公司），血清管（批号180601，江苏康健医疗用品有限公司），细胞因 子TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试 剂 盒（批 号20180830、20180830、20180830，北京四正柏公司）。

1.3 仪器

CP225D电子天平（德国赛多利斯公司）；HSS-1 B数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂）；低温离心机（美国西格玛公司）；Multiskan Mk3型酶标仪（美国赛默飞世尔公司）；CKX41倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；石蜡包埋机（中国湖北欧美莱医疗科技有限责任公司）；手动旋转式石蜡切片机(德国Slfe）。

2 实验方法

2.1 药物配制

2.1.1 阳性对照药柳氮磺吡啶混悬液的配制

将柳氮磺吡啶片粉碎，过100-120目筛。称取337.5 g粉末，以6750 mL 0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液配制为混悬液，4℃储存备用。按柳氮磺吡啶50 mg∕100 g大鼠体重给药。

2.1.2 乳香、醋乳香混悬液的配制

首先炮制醋乳香。按照2015版中国药典[1]和前期研究结果[2]，称取乳香适量，采用中火（设定电磁炉温度130℃），待锅底温度达到130℃后投入乳香，不断翻炒，炒制9 min后，按照10∶1的比例喷入陈放2年以上的米醋，继续翻炒2 min出锅，摊开晾凉，得到醋乳香。

分别称取乳香和醋乳香适量，在相同条件下粉碎，过100目筛，即得到乳香及醋乳香粉末。以70 kg人体用药量作为等剂量，制成含乳香或醋乳香的0.5%CMC-Na混悬液，用时摇匀，4℃储存备用。

2.2 UC模型建立及分组处理

2.2.1 造模方法[12]

采用SD雄性大鼠，体重280-300 g，适应性喂养2 d后，禁食不禁水36 h后，按照完全随机法，正常组10只，造模动物84只，分别给予2%戊巴比妥钠（45 mg·kg-1）腹腔麻醉，用直径2 mm的橡胶输液管缓慢推入距大鼠肛门约8 cm深的肠腔内。造模动物一次性将5%TNBS（100 mg·kg-1）水溶液和50%乙醇溶液的1:1混合液注入大鼠肛门，捏紧倒置保留5 min。正常组按同样方法，以同体积0.9%氯化钠溶液注入大鼠肛门。让动物保持平衡状态，均自然清醒后正常喂养。

2.2.2 分组及给药

除了上述正常对照组（A），将造模动物分为6组，即模型对照组（B）、乳香等剂量组（C，0.45 g·kg-1）、乳香2倍剂量组（D，0.90 g·kg-1）、醋乳香等剂量组（E，0.45 g·kg-1），醋乳香2倍剂量组（F，0.90 g·kg-1），阳性对照组（G，0.50 g·kg-1），每组10只。造模后第二天开始给药。给药组按上述剂量分别灌胃给药，正常组按10 mL∕kg剂量给予CMC-Na。每天给药1次，连续给药14 d。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠疾病活动指数（DAI）的观测[13-14]

造模成功后，每周称量大鼠体重并观察粪便情况。按表1评估大鼠DAI，DAI=（体重+大便形态+大便出血）∕3。

2.3.2 结肠黏膜损伤指数（CMDI）的观测[13-14]

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL∕100 g）进行麻醉后，将其固定于手术台。剥离结肠组织，用冰生理盐水冲洗干净，肉眼观察结肠粘膜损失指数评分。CMDI评分标准分为5级：肉眼观察结肠无损伤，记为0分；轻度充血，水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡，记为1分；充血水肿，黏膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠粘连，记为2分；高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径＜1.0 cm，记为3分；在3分基础上溃疡最大纵径＞1.0 cm，或全肠壁坏死，记为4分。

2.3.3 结肠组织学观察及评分（HS）[13-14]

取大鼠病变最明显的一段结肠组织，将其浸入10%中性甲醛缓冲液中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察结肠组织学变化并评分。HS评分标准分为4级：大鼠结肠肠黏膜无水肿、溃疡，无组织学病变，记为0分；肠黏膜轻度水肿、炎症溃疡、肉芽肿、上皮细胞异型增生，病变到达黏膜层，记为1分；肠黏膜中度水肿、炎症溃疡、肉芽肿、上皮细胞异型增生，病变到达肌层，记为2分；肠黏膜重度水肿、炎症溃疡、肉芽肿、上皮细胞异型增生，病变到达浆膜层最后所得的数值相加评分，记为3分。

2.3.4 血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的检测

打开大鼠腹腔，暴露腹主动脉。用5 mL的注射器采集全血，保存于血清促凝管。静置2 h后，4℃低温离心10 min（2500 r·min-1），吸取上清液，分装，于-80℃保存备用。采用ELISA法分别对各组大鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平进行测定，均按照试剂盒说明书进行操作。

2.4 统计分析

表1 DAI的评分标准

3 结果

3.1 DAI、CMDI及HS评分结果

与正常组大鼠比较，模型大鼠DAI、CMDI及结肠HS评分均明显上升，并具有极显著性差异（P＜0.01）；各给药组在给药治疗后，DAI、CMDI及结肠HS评分均显著低于模型组（P＜0.01），且由低到高依次为醋乳香2倍剂量组、醋乳香等剂量组、乳香2倍剂量组、乳香等剂量组。其中，醋乳香组DAI与乳香等剂量组之间在给药1周后的差异具有统计学意义（P＜0.01）；醋乳香2倍剂量组CMDI及结肠HS评分与其他给药组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.01）（表2，表3）。

3.2 结肠组织病理切片结果

正常组大鼠结肠黏膜完整，未见溃疡、水肿，也无炎症细胞浸润（图1A）。模型组可见炎症累及肠壁全层，部分表面上皮脱落，隐窝破坏，肌层肉芽组织生长，腺体排列不规则，淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润，符合溃疡性结肠炎的组织病理学改变，病变最为严重（图1B）。经乳香及醋乳香干预后，各给药组呈现不同程度的修复作用，显微镜下可见较局部的隐窝破坏伴有上皮再生修复和腺体增生，增厚的炎症组织与正常组织交织，中性粒细胞浸润，伴有巨噬细胞、淋巴细胞、纤维细胞存在，腺体也有不同程度的改善，而乳香等剂量组（图1C）及2倍剂量组（图1D）病理改变逊色于醋乳香等剂量组（图1E）及2倍剂量组（图1F）。

表2 DAI评分的比较（±s,n=10）

表2 DAI评分的比较（±s,n=10）

注：与正常组比较**P＜0.01；与模型组比较##P＜0.01；与乳香等剂量组比较^^P＜0.01。

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表3 CMDI以及HS评分的比较（x±s,n=10）

3.3 血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6检测结果

结果显示（图2），正常组与模型组大鼠血清中细胞因子的水平分别为TNF-α：91.93±16.95、232.60±33.201 pg·mL-1，IL-1β：34.00±25.53、249.71±25.527 pg·mL-1，IL-6：336±77.79、587.67±103.62 pg·mL-1，模型组高于正常组，且具有极显著性差异（P＜0.01）。阳性对照组低于模型组，且具有极显著性差异（P＜0.01）。

图1 各组结肠组织病理切片结果

图2 大鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达

乳香与醋乳香等剂量组给药后，结肠炎大鼠血清中各细胞因子水平分别为：TNF-α：148.60±45.05、111.933 ±44.78 pg·mL-1，IL-1β：88.29±22.23、66.86±24.31 pg·mL-1，IL-6：436.00±114.20、417.67±103.71 pg·mL-1，与模型组相比，均显著降低（P＜0.05）。而乳香与醋乳香等剂量组间没有统计学差异，但从数值趋势上看，醋乳香较乳香炎症因子水平更低。

乳香与醋乳香2倍剂量组血清中各细胞因子水平分别为：TNF-α：143.27±26.38、101.93±49.10 pg·mL-1，IL-1β：74.00±12.96、39.71±33.38 pg·mL-1，IL-6：434.33±97.87、399.33±128.61 pg·mL-1，与模型组相比，均显著降低（P＜0.05）。两个给药组之间虽无显著性差异，但从数值趋势上看醋乳香2倍剂量组较乳香炎症因子水平更低。

另外，醋乳香等剂量组与2倍剂量组之间虽无显著差异，但从数值趋势上来看，醋乳香2倍剂量组炎症因子水平明显低于等剂量组。

4 讨论

UC是一种自身免疫性疾病，与精神、感染、免疫、遗传等多种因素密切相关，其病程长，易反复发作[15]。TNF-α、IL-1β和IL-6在UC中被公认为是促炎细胞因子，参与UC炎症反应和免疫应答[16]。研究证明细胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6水平在UC患者血清中显著升高，且与病变程度及累及范围相关，病情缓解后3种炎症因子水平显著降低[17-18]。本研究结果显示，TNBS∕乙醇造模后，模型组大鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平均显著高于正常组，结合DAI、CMDI、HS评分以及病理学切片，显示大鼠UC模型造模成功。三种细胞因子在阳性对照组中的表达水平显著低于模型组，说明实验具有可靠性。乳香和醋乳香各给药组大鼠DAI、CMDI以及HS评分均显著低于模型组，三种细胞因子的表达水平均显著低于模型组，说明乳香、醋乳香可以通过降低炎症因子水平对UC具有明显的治疗作用。综合各指标的数值趋势，提示醋乳香的抗炎作用优于乳香，且以2倍剂量组作用最显著。

乳香中主要含有五环三萜、四环三萜、大环二萜以及挥发油等成分[19-21]。骨架结构为五环三萜类化合物的乳香酸组分（Boswellic Acids,BAs），是其最主要的活性组分，具有抗炎作用[22-24]。11-羰基-β-乳香酸（11-keto-β-boswellic acid，KBA）、3-乙酰-11-羰基-β-乳 香 酸（3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA）、α-乳香酸（α-boswellic acid，α-BA）、β-乳香酸（β-boswellic acid，β-BA）、3-乙酰-α-乳香酸（3-acetyl-α-boswellic acid，α-ABA）和3-乙酰-β-乳香酸（3-acetyl-β-boswellic acid，β-ABA）为含量最高的6种乳香酸成分[18]。其中，含有11位羰基结构的11-羰基乳香酸和3-乙酰-11-羰基乳香酸抗炎作用最强[25]。而乳香醋炙后，五环三萜类成分含量显著增加，尤以含有11位羰基结构的乳香酸含量增加最多[2]。同时，醋炙后含量显著增加的还有9，11-α-去氢-乳香酸、9，11-β-去氢-乳香酸、3-乙酰-9，11-α-去氢乳香酸和3-乙酰-9，11-β-去氢乳香酸，有报道显示相较于醋炙前的11-羰基结构成分，具有9，11去氢结构的乳香酸抗炎活性更强[26]。另一方面，乳香酸类成分生物利用度较低，而乳香醋炙后两个主要乳香酸成分KBA和AKBA的血药峰浓度（Cmax）以及药时曲线下面积（AUC）均显著增加[27]。肠外翻实验也显示，主要乳香酸成分在乳香醋炙后肠渗透率显著增加[28]。醋炙后乳香酸成分含量增加，同时吸收作用增强，这些变化应该都与乳香醋炙后抗炎活性的增强有关。因此导致了与乳香相比，醋乳香可以对UC发挥更加显著的治疗作用。本研究在丰富中药传统炮制理论同时，也为UC临床治疗提供了思路。