牛大力组织培养技术研究

陆滟灵 林敏 安冰

摘要    本试验通过组织培养手段，以牛大力种子为材料，对外植体诱导及无菌组织培养进行了尝试，以期获得牛大力外植体诱导、增殖和生根的适宜培养基和培养条件。结果表明，消毒方式为75%酒精消毒30 s+0.1%氯化汞消毒15 min，外植体诱导培养基为改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+琼脂6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+益培灵0.20 g/L，增殖培养基为改良MS+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+益培灵0.10 g/L，生根培养基为改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+瓊脂6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+益培灵0.05 g/L，较适宜牛大力组织培养。

关键词    牛大力;组织培养;外植体

中图分类号    S567.19        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）11-0069-02              开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Research  on  Tissue  Culture  Technology  of  Millettia  specisoa

LU Yan-ling    LIN Min    AN Bing *

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming Guangxi 532500）

Abstract    In this experiment，tissue culture was carried out with Millettia specisoa Champ. seeds as the material，explant induction and aseptic tissue culture were attempted，in order to obtain the suitable culture medium and culture conditions for explants induction，multiplication and rooting of Millettia specisoa. The results showed that，the disinfection method was 75% alcohol disinfection for 30 s+0.1% HgCl2 disinfection for 15 min，the explant induction medium was improved 1/2 MS+sucrose 15 g/L+AGAR 6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+Yipeiling 0.20 g/L，and the multiplication medium was improved MS+sucrose 30 g/L+AGAR 6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+Yipeiling 0.10 g/L，the rooting medium was improved 1/2 MS+sucrose 15 g/L+AGAR 6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+Yipeiling 0.05 g/L，which was more suitable for Millettia specisoa tissue culture.

Key words    Millettia specisoa Champ.;tissue culture;explant

牛大力（Millettia specisoa Champ.），学名崖豆藤，豆科崖豆藤属植物[1]。牛大力性味甘、平，具有补虚润肺、强筋活络的功效，药食两用，是生产多种中成药的主原料。近年来，随着市场需求的增加，牛大力野生资源日趋枯竭，其育苗培养主要通过播种育苗和扦插育苗的方式[2]，以种子为外植体材料进行牛大力组培快繁的研究鲜有报道。本试验采用野生牛大力种子为外植体，开展组织培养技术研究，以期建立组织培养体系，为野生牛大力组培快繁提供参考[3]。

1    材料与方法

1.1    试验材料

供试牛大力种源来自于广西宁明县，采收成熟的新鲜野生荚果种子。

试验所用的组培高效抑菌剂——益培灵购自上海宇涵生物科技有限公司，是一种新型组织培养专用防污染杀菌剂。益培灵抑菌剂的作用机理是穿透微生物的细胞壁进入细胞内部，通过干扰复制或断开微生物关键蛋白质的键而发挥杀菌作用。

1.2    试验设计

试验设计见表1，每个处理3次重复，每个重复接种100粒牛大力种子，数据取3次以上平均数。试验中所用的外植体诱导、增殖和生根培养基pH值均为5.5～5.6，在121 ℃高温下灭菌15 min，冷却后备用。试验选择新鲜饱满的种子作外植体，用饱和洗衣粉溶液刷洗干净，灭菌后接种到培养基上培养。无菌体培养条件为光强3 000 lx、温度25 ℃。

2    结果与分析

2.1    外植体消毒

试验结果表明，污染率与消毒处理时间成反比，灼伤率则与消毒处理时间成正比。其中，处理A污染率最高，分别是处理D、C、B的3.1、2.3、1.4倍;灼伤率最低，处理B、C、D分别是处理A的1.8、2.6、6.2倍（表2）。根据试验结果可知，灭菌方式C最为适宜，污染率和灼伤率均在最佳范围。灼伤率过高时，褐化现象严重，甚至抑制种子的萌发。在实际操作中，可将15 min灭菌过程分作2次8 min灭菌，中间用无菌水清洗数次，对灭菌效果影响不大，且对褐化、灼伤现象有较明显的抑制作用。

2.2    外植体诱导阶段

试验结果表明，外植体诱导阶段处理B萌芽率为90%，效果最好，分别较处理A、C、D高出12.5%、26.8%和38.5%;4个处理污染率无显著差异，平均污染率为15%（表3）。说明在低浓度时，萌芽率与6-BA+NAA浓度成正比;超过一定的浓度，萌芽率则随浓度升高呈下降趋势，且浓度过高时，牛大力芽苗纤细、生长缓慢、出现叶片黄化现象，并伴随愈伤组织异常。

2.3    增殖培养阶段

由表4可知，在牛大力增殖培养阶段，在6-BA+NAA低浓度时增殖倍数随浓度升高呈现出递增趋势，超过一定浓度则为递减趋势。增殖培养阶段处理B增殖倍数为5.8，有效芽最多，茎轴健壮，复叶翠绿，为最佳培养基配比。处理D增殖倍数最低，分别较处理A、B、C低14.3%、27.6%和17.6%。4个处理的污染率相差不大，平均值为8.2%。

2.4    生根培养阶段

试验结果表明，生根培养阶段处理B最优，生根率为68%，根系健壮，侧根发达，较处理A、C、D生根率分别高出13.3%、15.3%和44.7%;4个处理污染率差异不大，均在6%左右（表5）。试验数据分析表明，在牛大力生根阶段，在低浓度时生根率随IBA+ABT1浓度升高呈现出递增的趋势，超过一定浓度后呈现出递减的趋势。

3    结论与讨论

试验结果表明，消毒方式为75%酒精消毒30 s+0.1%氯化汞消毒15 min，诱导培养基为改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+琼脂6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+益培灵0.20 g/L，增殖培养基为改良MS+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+益培灵0.10 g/L，生根培养基为改良1/2MS+蔗糖15 g/L+琼脂6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+益培灵0.05 g/L时，培养效果较好。新鲜的牛大力种子萌发率最高，当天剥开果壳的种子萌动快、发芽率高且污染率低[4]。不同濃度激素对野生牛大力组培各阶段都有显著影响，均表现为低浓度时促进、超过一定浓度后抑制。浓度配比适宜时，苗木健壮，叶片翠绿，生长迅速，有效芽多;激素浓度过高，则多发生畸形、玻璃化等现象，易形成白色松散的愈伤团;激素浓度过低，又影响萌动，这与相思树等其他树种的组织培养有相似性[5]。牛大力是木质藤本植物，在本试验中，生根率最高仅为68%，这与其他研究结果类似[1，6]。因此，牛大力生根培养适宜的生长素种类及最佳浓度配比，还有待进一步的研究。

传统中药材牛大力食药兼用，在药理研究中，具有保护和修复辐射损伤、调节免疫功能、护肝、祛痰、平喘等功能[7-8]。其化学成分分析显示，牛大力富含黄酮类化合物、多糖及多种微量元素，具有药源充足、疗效显著、毒副作用较小、不易产生耐药性等优点，具有相当广阔的应用前景[9-11]。近年来，牛大力野生资源遭到了极大的破坏，几近枯竭，利用组织培养技术进行牛大力快繁具有重要的意义，有待于进一步的研究深入，完善技术体系，在理论和生产上提供技术参考。

4    参考文献

[1] 潘颖南，张向军，蒙平，等.药用植物牛大力组织培养初探[J].广西农业科技，2010，41（6）：523-525.

[2] 黎瑞汝，陈占科，高珊，等.中药牛大力的研究进展[J].亚太传统医药，2010，12（6）：164-168.

[3] 时群，陈丽文，陈乃明，等.牛大力种子组培快繁技术研究[J].安徽农业科学，2011，44（21）：138-141.

[4] 李冬萍.中药材牛大力离体培养与繁育的研究[D].南宁：广西大学，2013.

[5] 蔡玲，王以红，吴幼媚，等.五种相思树组织培养研究[J].广西林业科学，2003，32（1）：27-29.

[6] 黄碧兰，徐立，李志英，等.牛大力茎段组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：93-94.

[7] 杨川川，蔡艳虹，梁天坚，等.牛大力药理及毒理作用的研究进展[J].大众科技，2018，20（11）：44-47.

[8] 田纪祥，钟俊武.牛大力提高小鼠免疫功能的实验研究[J].现代医学与健康研究电子杂志，2018，2（10）：59.

[9] 陈黄保.甜牛大力和苦牛大力的生药研究[J].中草药，2001，32（9）：843-845.

[10] 黄江燕，唐专辉，李典鹏，等.牛大力多糖含量的测定[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1180.

[11] 杨民胜，李天会.中国桉树研究现状与科学经营[J].桉树科技，2005，22（2）：1-6.

作者简介   陆滟灵（1981-），女，广西宁明人，助理工程师。研究方向：组织培养和森林培育。

通信作者

收稿日期   2020-03-04