嵊泗养殖厚壳贻贝卫生监测及健康风险评估

陈 瑜，金 雷，陈 思，郭远明，朱敬萍

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

厚壳贻贝Mytilus coruscus，其干制品为淡菜，雅称“东海夫人”。厚壳贻贝中含蛋白质10.2%～14.6%，还含有各种微量元素，如VB2、VB12、VA、VD、VE 等，又含有人体所需的金属元素钙、铁、锌等以及各种氨基酸等，其营养价值之高，药用范围之广，深受人们喜爱。近年来，厚壳贻贝产业依靠其显著的经济效益、社会效益、生态效益，已当之无愧地成为了嵊泗县重要海洋支柱产业。嵊泗县一直将助推贻厚壳贝特色产业发展作为重点工作来抓，通过综合施策，精心扶持，全力打造嵊泗传统优势产业“金名片”。目前，全县共有厚壳贻贝养殖户860 家，贻贝深加工生产线24 条，解决就业6 000 余人。2017 年，嵊泗全县厚壳贻贝养殖面积有2.03 hm2，占养殖面积的90.6%，总产量逾12×104t，总产值达4 亿多元[1]。嵊泗厚壳贻贝的养殖区域主要集中在枸杞、嵊山、壁下、绿华四岛。

然而，厚壳贻贝属于滤食性生物，在滤食饵料生物的同时，会将水体中的微生物吸入体内，食用病原微生物寄生的贝类极易引发疾病，从而暴发贝类中毒事件。同时，厚壳贻贝还会富集养殖水体及饵料中的重金属，一旦污染或进入食物链就很难消除，这些都增加了其食用风险。近年来我国贝类中毒的事件频繁发生，对消费者的身体健康、生命安全和贝类产品出口构成了严重的威胁，对国家和人民群众造成重大的经济损失[2]。本研究于2016-2018 年对嵊泗县的枸杞、嵊山、壁下、绿华四岛养殖厚壳贻贝抽样监测，了解嵊泗近年厚壳贻贝生产的卫生安全状况，旨在对其食用安全性做出正确的评价和为各种中毒事件的处理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 采样站位的设置

于2016-2018 年连续3 年对嵊泗县境内枸杞、嵊山、壁下、绿华四岛进行采样，采样时间选择在6 月和8 月，这两个时间段分别为贝类的生长期和收获期，监测结果作为划型依据，能反映贝类的整体质量状况。共设30 个站位点，采集样品数量180 个，见表1。

表1 嵊泗四岛贝类监测站点Tab.1 Shellfish monitoring stations on four islands in Shengsi

1.2 材料与试剂

采集嵊泗贝类养殖区的厚壳贻贝，每个站位点采集1 个样品，每个样品抽样量为(1 000±200) g。样品先用海水洗净后，装在聚乙烯袋中冷藏，保存于泡沫箱中，尽快送回实验室检测[3]。

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、EC 肉汤（E.coli Broth）、伊红美蓝（EMB）琼脂、营养琼脂、平板计数琼脂（PCA）、HBI 生化鉴定试剂盒均购自青岛海博生物技术有限公司（所有培养基均需121 ℃高压灭菌20 min）[4]；硝酸(优级纯及以上)、丙酮、无水乙醚、吐温-60、氯化钠均购自国药集团化学试剂有限公司；铅和镉标准贮备溶液(1 000 μg·mL-1)均购自国家标准物质研究中心；实验用水，符合GB/T 6682-2008 二级水要求。

1.3 主要仪器及型号

隔水式恒温培养箱GHP-9270；智能光照培养箱GXZ；生物安全柜BSC-1000ⅡA2；立式高压蒸汽灭菌器LDZX-30FB；原子吸收光谱仪 安捷伦AA240；微波消解仪ETHOS 1；微控数显电热板及蒸酸架EH20A plus；其余均为试验室常用设备。

1.4 检测方法和风险评价及健康风险评估方法

重金属及贝类毒素测定前直接将贝类活体剥壳，取肉进行匀浆后测定[5]。

1.4.1 大肠杆菌和菌落总数的测定

大肠杆菌按照GB 4789.38-2012 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数。称取25 g 贝肉，放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液中均质，制作成1:10 的样品匀液。选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3 管，然后放入培养箱中培养。经过初发酵、复发酵和生理生化试验，计数阳性管数，查MPN 表。

菌落总数按照GB 4789.2-2010 食品微生物学检验菌落总数测定。称取25 g 贝肉，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液中均质，制作成1:10 的样品匀液。然后，选择合适的3 个稀释度，每个稀释度做2 个平板，用灭菌冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，（30±1）℃培养（72±3）h。选择菌落数在30～300 CFU 之间连续两个稀释度的平板，按公式计算2 个平板菌落数的平均值[4]。

1.4.2 重金属的测定

采用微波消解进行前处理，称取0.5 g 左右贝肉于微波消解罐中，加入5.0 mL 硝酸轻摇后静置过夜，按设定的消解工作程序进行消解。消解完毕后将消解罐置于控温蒸酸架上赶酸至其内样液剩1～2 mL 左右。冷却后将消解液移入25 mL 具塞比色管内用蒸馏水稀释至刻度线[5]，待测。本实验采用GB 5009.268-2016 中第一法ICP-MS 法进行铅、镉含量的测定。

1.4.3 腹泻性贝类毒素测定

腹泻性贝类毒素按照GB 5009.212-2016 食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定中小鼠生物法进行测定。用丙酮提取贝类中腹泻性贝类毒素，经无水乙醚分配，减压蒸干后，再以含1%吐温-60 的生理盐水为分散介质，制成混悬液。将混悬液注射入小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。

1.4.4 铅和镉污染程度评价方法

为客观评价2016-2018 年嵊泗4 岛养殖贻贝中铅和镉的污染程度，依据GB 2762-2017《食品中污染物限量》，采用单因子污染指数对贻贝样品进行风险评估。按下式计算：

式中：Pi为单因子污染指数；Ci为水产品中可食部分中某种重金属含量mg·kg-1；Si为该种水产品评价标准值最高允许值mg·kg-1。

依据“海洋生物污染评价标准”[6]，当Pi＜0.2 时，表明该种重金属含量处于正常范围，为未污染水平；0.2≤Pi≤0.6 时，表明处于轻污染水平；0.6＜Pi＜1.0 时，为中度污染水平；Pi＞1.0 时，则为重度污染。

1.4.5 铅和镉健康风险评估模型

美国环境保护署（USEPA）用靶标危险系数法（THQs）评估人体通过每日食物中摄取重金属所造成的健康风险水平，按下式计算[7]：

式中：EF 为人群暴露频率（365 d·a-1）；ED 为暴露年限（按人类平均寿命年龄76.34 计[8]）；FIR 为食物摄取率（根据联合国粮农组织FAO 的统计数据，软体类为每人9.8 g·d-1[9]）；c 为食物中的重金属含量（mg·kg-1）；RFD 为每日参考剂量（铅：0.004 mg·kg-1；镉：0.001 mg·kg-1）WAB 为成人平均体重（按60 kg 计）；TA 为非致癌源的平均暴露时间(365 d·a-1×ED)。

假定人体摄入剂量等于吸收剂量，以测定的摄入量与参考剂量的比值作为评价标准，若THQ 比值＜1，一般评价暴露人群无明显健康风险，反之则存在健康风险。

2 结果与讨论

2.1 近3 年监测结果比较

2.1.1 微生物监测结果

根据农业部《海水贝类养殖生产区划型要求》，分析大肠杆菌3 年数据，在贝类养殖区中2016 年贝类样品大肠杆菌指标达一类标准为34 个，比例为56.7%，2017 年贝类样品大肠杆菌指标达一类标准为51个，比例为85.0%，2018 年贝类样品大肠杆菌指标达一类标准为52 个，比例为86.7%，2018 年与2016 年相比，上升了52.9%。查阅2017 和2018 年舟山市天气气候公报[11-12]发现2017 年舟山市年降水量平均为1 411.8 mm，同比上年减少173.5 mm，偏少11%；2018 年舟山市年降水量平均为1 345.6 mm，同比上年减少66.2 mm，偏少5%。因此分析原因，2017 和2018 年大肠杆菌指标达一类区比例大幅上升可能与近年雨水较少，被雨水冲刷携带生活污水等地表径流的流入量随之减少，微生物生长缓慢有关[13]。

2016 年和2017 年批次贝类样品菌落总数指标最高数值分别为4.7×105和1.1×105CFU·g-1，均小于5×105CFU·g-1的限量值[14]。而2018 年菌落总数最高数值为1.2×106CFU·g-1，并且有3 个样品超过最大限量值。同时2018 年嵊泗县养殖厚壳贻贝菌落总数均值最高，主要原因可能是当年夏季枸杞岛游客数量同比上年度增长迅速，游客在短期内的上升和海上活动增加，污染了养殖区环境，导致2018 年菌落总数均值偏高，见表2。

表2 3 年嵊泗县贻贝微生物监测结果Tab.2 Monitoring results of mussel microorganisms in Shengsi county in recent three years

2.1.2 重金属监测结果

由图1 可知，嵊泗县养殖厚壳贻贝中镉含量逐年下降，2018 年比2016 年下降了41.7%，铅含量均值2017 年最低为0.056 mg·kg-1，2018 年略有回升，与2016 年相比下降37.5%。结合图2 分析发现，四岛中厚壳贻贝铅含量均呈先下降后缓慢上升的趋势，而镉含量除枸杞岛呈逐年下降趋势外其他三岛均与铅含量变化趋势相同。不难看出，正是因为2018 年枸杞岛厚壳贻贝镉含量的下降，导致2018 年厚壳贻贝镉含量均值比2017 年低23.6%。180 个样品镉含量均符合《食品中污染物限量》（GB 2762-2017）要求，近3 年样品最高含量值发生在2017 年，为1.9 mg·kg-1，与2016 年样品最高含量值1.2 mg·kg-1相比，增加了58.3%。180 个样品铅含量均符合《食品中污染物限量》（GB 2762-2017）要求，近3 年样品最高含量值发生在2018 年，为0.33 mg·kg-1，与2016 年样品最高含量值0.24 mg·kg-1相比，略有上升。

图1 3 年嵊泗县厚壳贻贝中镉、铅含量平均值趋势图Fig.1 Analysis chart of Cd and Pb in mussels in Shengsi county from 2016-2018

2.1.3 腹泻性贝类毒素监测结果

近3 年经检测60 个厚壳贻贝样品腹泻性贝类毒素全部为未检出，合格率100%，符合农渔发[2018]5号文件要求。

2.2 四岛厚壳贻贝卫生监测结果比较

2.2.1 微生物监测结果

如表3 所示，2016-2018 年各岛一类养殖区数量均有大幅提高，2017 年壁下和枸杞岛一类养殖区个数达到100%；2018 年嵊山岛和绿华岛一类区个数同比上年增加57.3%和12.4%，壁下和枸杞岛一类养殖区比例略有回落；对比菌落总数的数据分析发现，总的来看近3 年绿华和壁下两岛菌落总数均值相对较低，2018 年枸杞岛有3 个样品菌落总数超标，超标率达12.5%，导致枸杞岛菌落总数平均值大幅上升。分析以上监测结果的原因，2018 年壁下、枸杞两岛一类养殖区个数略有下降，菌落总数均值有所上升，可能与嵊泗县旅游业发展，游客涌入人数逐年增加导致岛上生活垃圾激增、海上活动频繁有关；由于嵊山和绿华岛游客相对较少以及舟山市文明城市建设与整治生活垃圾工作的推进，嵊山岛一类养殖区逐年增加，2018年突破90%，绿华岛亦有所增加。

表3 嵊泗县四岛贻贝微生物监测结果Tab.3 Microbial monitoring results of mussels on four islands in Shengsi

2.2.2 重金属监测结果

研究嵊泗四岛2016-2018 年养殖厚壳贻贝中重金属变化，发现在2017 年铅含量均为最低值，随时间呈先下降后小幅回升趋于稳定，并且在3 年内，一直维持绿华、壁下、嵊山、枸杞四岛贻贝铅含量从低到高的规律；由图2 可知，除枸杞岛外，其余三岛贻贝镉含量亦呈先下降后小幅上升趋向稳定，且枸杞岛在2016 年和2017 年贻贝镉含量均值为四岛最高。枸杞岛上有4 家水产企业，贻贝养殖区内有少量航道，且是4 个岛当中旅游开发最早、游客数量最多的一个岛，地区经济发展，生活污水、工业废水、农业面源污染物等排放入海，由于贝类对水体重金属的富集作用，贻贝中重金属含量相较其他3 岛略高。然而到2018 年枸杞岛贻贝镉含量降至0.38 mg·kg-1，仅比壁下岛高出0.07 mg·kg-1，推断可能与2018 年舟山市倡导文明城市建设，该岛整治工业废水、农业面源污染治理的推进以及近年来废水中镉含量减少有关。

图2 3 年嵊泗四岛贻贝中铅、镉含量趋势图Fig.2 Trend map of Pb and Cd in Mussels on four islands in Shengsi from 2016-2018

2.2.3 铅、镉污染程度评价和健康风险评估

2.2.3.1 铅、镉污染程度评价

采用单因子评价模式对厚壳贻贝样品的铅、镉含量水平进行评价，结果显示2017 年壁下岛和嵊山岛厚壳贻贝中铅的污染指数Pi小于0.2，说明厚壳贻贝样品未受污染，2016 年枸杞岛厚壳贻贝中铅的污染指数Pi大于0.6，属于中度污染水平，其他站点样品Pi 均在0.2～0.6 范围内，判断为铅轻度污染；2017、2018年壁下岛和2018 年枸杞岛厚壳贻贝样品镉污染指数Pi小于0.2，说明厚壳贻贝样品未受污染，其他站点样品Pi为0.2～0.6，为镉轻度污染，见表4。总体而言，嵊泗县厚壳贻贝中铅和镉受污染程度不高，属于轻度污染水平，仅个别站点中铅属于中度污染水平。

表4 厚壳贻贝样品中铅、镉污染因子的污染指数（Pi）Tab.4 The pollution (Pi) index of Pb and Cd pollution factors in mussel samples

2.2.3.2 铅、镉健康风险评估

由表5 可知，绿华、壁下、嵊山和枸杞岛的养殖厚壳贻贝中铅和镉的THQ 均远远小于1，说明四岛厚壳贻贝中铅和镉含量处于安全水平，无健康风险。

表5 嵊泗厚壳贻贝Pb、Cd 健康风险评价(THQ)Tab.5 health risk assessment of heavy metals in mussels in Shengsi（THQ）

3 结论

本文分不同时间和不同岛屿对嵊泗县厚壳贻贝养殖区卫生现状进行调查分析，实验发现2016～2018年嵊泗县贝类养殖区中厚壳贻贝样品大肠杆菌指标达一类区整体比例从2016 年的56.7%上升到2018 年的86.7%，提高了52.9%；绿华、嵊山岛一类养殖区个数逐年增加，其它两岛在2017 年一类养殖区比例为100%，至2018 年稍有回落，总体趋于平稳。养殖厚壳贻贝中镉含量逐年下降，铅含量呈先下降后缓慢上升的趋势；分析嵊泗四岛厚壳贻贝中重金属含量，绿华和壁下2 岛相对较低，4 个岛厚壳贻贝中铅含量均随时间变化所呈现先下降后上升的趋势，与年度总体变化趋势一致，绿华、壁下、嵊山3 岛厚壳贻贝镉含量随时间变化呈现先下降后上升的趋势，枸杞岛厚壳贻贝镉含量呈逐年下降趋势。通过对铅、镉污染程度评价和健康风险评估发现除2016 年枸杞岛厚壳贻贝中铅的污染指数Pi＞0.6，属于中度污染水平，其他站点样品Pi≤0.6，说明嵊泗县厚壳贻贝中铅和镉受污染程度不高，属于轻度污染水平。4 个岛厚壳贻贝重金属THQ＜1，说明四岛厚壳贻贝中铅和镉含量处于安全水平，无健康风险。通过实验数据不难看出，嵊泗县厚壳贻贝养殖区的养殖环境在不断改善，一类养殖区个数逐年提高，食用嵊泗厚壳贻贝引起的铅和镉的暴露较轻微，无明显健康危险[15]。