长期低盐胁迫对梭鱼生长及生理的影响

张鼎元，柴学军，阮泽超，张 燕，王跃斌

(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021)

盐度作为水环境重要的理化因子，其变化对鱼类的胚胎孵化率、仔稚鱼的存活率、幼鱼及成鱼的生长发育等整个生命周期均有重要影响[1]。鱼类所处环境水体盐度偏离渗透压时，其耗氧率、排氨率会因偏离程度的增大而增加，代谢能随之升高，进而影响能量收支[2]。故在获取同等能量的前提下，鱼类生活在等渗点附近盐度的水体中，可以节省调节离子和渗透调节所消耗的能量来用于生长，也因此许多广盐性鱼类有生长率较高的盐度范围[3]。

当生境盐度发生变化时，鱼体的应激反应分为初级阶段机体神经水平上的响应以及与其它渗透调节激素间的共同作用，包括鱼体内的生长激素(growth hormone，GH)、皮质醇(cortisol，COR)、催乳素(prolactin，PRL)、钠钾泵(NKA)[4-5]。另外，鱼类超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)的活性受到外在盐度变化的影响[6]，研究鱼类的渗透生理以及非特异性免疫酶类对低盐胁迫的响应对于提高养殖效果具有显著的意义。

梭鱼Liza haematocheila，又称西鱼、赤眼鲻、黄鲻、红目鲢、红目呆。分类上属于辐鳍鱼纲、鲻形目、鲻科、梭鱼属。食性以植、腐食性为主，是我国北方重要传统养殖鱼类，也是沿海咸淡水养殖鱼类中的主要种类[7]。梭鱼广盐、广温，对盐度的适应范围为0～38，温度适应范围为0.7～35 ℃。梭鱼具海鲜风味，营养丰富，俗称“肉滚子”，通体仅1 根主刺且个体较大，具良好加工品质[8]。本试验研究了不同盐度对梭鱼幼鱼生长性能、渗透生理、非特异性免疫酶类及低盐胁迫相关组织的影响，探讨梭鱼适应盐度的生理机制，旨在为提高梭鱼养殖水平提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼与试验条件

本试验于2019 年9 月至10 月在浙江省海洋水产研究所西轩渔业科技岛内进行，实验期间水温19.2～22.1 ℃，试验养殖水桶规格为200 L，试验用梭鱼为海捕个体。本试验所用水桶和鱼种放养前进行消毒处理，饲养期间若发生死鱼情况，及时清理并进行无害化处理，以免传染其他鱼体。

1.2 试验方法

将海捕梭鱼幼鱼暂养与室内水泥池内，每天早晚(08:30，16:00)投喂日本株式林兼会社虎豚商业饲料，投至饱食，喂食1 h 后用虹吸法将残饵及粪便吸出，盐度驯化期间正常投喂。暂养2 周后，挑选大小相近的梭鱼540 尾平均分入18 个实验桶内，鱼体平均体重(8.78±1.67) g。

试验设5 个组，这5 组的盐度分别为0、5.0、10.0、15.0、25.0(对照)，每组设3 个平行。本试验中，将盐度于1 周内调节至各个目标浓度，低盐度组用除氯自来水与沙滤海水配制而成。本试验周期为6 周。

1.3 样品采集与处理

每组抽取20 尾梭鱼测量鱼体质量，记录饲料投喂量。实验结束后，先测定实验鱼生长数据，再将其置于冰盘中，用1 mL 注射器于尾静脉采血，4 ℃条件下以2 000 r·min-1低温离心20 min，取上清液置于-70 ℃冰箱保存，待检。

采集实验鱼左侧和右侧第2 鳃弓上的鳃丝、肝脏、脾脏，用生理盐水润洗，置于9 倍体积8 mg·mL-1的生理盐水中，用匀浆仪进行冰浴匀浆，4 ℃下以1 000 r·min-1离心5 min，取上清液置于-30 ℃冰箱保存，待检。

酶活性的测定：将鳃、肝、脾组织匀浆上清液加生理盐水稀释至5%后，采用康为世纪BCA 蛋白定量试剂盒测定组织蛋白浓度。将鳃组织匀浆上清液稀释至2%测定NKA 活力；肝脏组织匀浆上清液稀释至2%测定SOD 活力、至2.5%测定CAT 活力；MDA 含量的测定直接采用10%的肝脏组织匀浆上清液。AKP 的测定直接采用10%的脾脏组织匀浆上清液。以上各种酶活均采用南京建成生物生物工程研究所相关试剂盒进行测定

激素的测定：血清激素(GH，COR，PRL 等)的测定采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。原理为：血清中的激素(GH，COR，PRL 等)与其特异性抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体反应，后用底物四甲基联苯胺(TMB)进行显色反应。在450 nm 波长下测定吸光度，依据标曲计算激素浓度(ng·mL-1)。

1.4 数据处理

采用Excel 2003 软件对试验数据进行初步整理，再用SPSS 17.0 软件对数据进行回归分析和单因素方差分析。若影响显著，则用Duncan’s 法进行多重比较，显著性水平设为0.05。描述性统计值均以平均值±标准差(mean±S.D)表示。

2 结果

2.1 低盐胁迫对梭鱼生长及摄食的影响

由表1 可知：经过42 d 的低盐胁迫处理后，只有0 盐度组的成活率为98.89%，其余各盐度组均为100%，这证明梭鱼在低盐胁迫下甚至淡水中均能成活。在0～42 d 内，S0、S5、S10 和S25(对照组)的特定生长率分别约为0.89%，1.05%，1.09%，1.03，均显著低于S15 的1.16%(P<0.05)；5 个组的增重率及饲料系数也有相似的规律，均在S15 组最优，且显著高于其他各组(P<0.05)。S5 盐度组摄食率最低为1.65%，其余各组差异不显著(P＞0.05)。

表1 低盐胁迫下梭鱼幼鱼成活、生长及摄食情况Tab.1 Survival,growth and feeding of juvenile L.haematocheila under low salt stress

2.2 低盐胁迫对梭鱼幼鱼渗透调节相关激素的影响

不同盐度低盐胁迫对下梭鱼幼鱼血清中GH 浓度的影响如图1。结果显示，随着盐度的上升，梭鱼血清中GH 含量呈上升的趋势。其中盐度S0 组GH 含量最低为6.32 ng·mL-1(P<0.05)；而血清GH 含量在S25(对照组)中达到峰值8.51 ng·mL-1(P<0.05)。

图1 低盐胁迫对梭鱼幼鱼血清GH 浓度的影响Fig.1 Effect of low salt stress on serum GH concentration of L.haematocheila

不同盐度低盐胁迫对梭鱼幼鱼血清COR 浓度的影响如图2。结果显示，在本实验采用的5 种盐度条件下，梭鱼血清中COR 浓度随着盐度升高呈现先下降后上升的趋势，在盐度为25 时达到最高值13.50 ng·mL-1，较最低的盐度0 组高了28.57%，与其余各组差异显著(P<0.05)。

图2 低盐胁迫对梭鱼幼鱼血清COR 浓度的影响Fig.2 Effect of low salt stress on serum COR concentration of L.haematocheila

根据图3 可知，低盐胁迫对下梭鱼幼鱼血清中PRL 浓度变化趋势与GH 相反，随着盐度的升高其浓度随之下降，在S25(对照组)中PRL 含量最低为0.74 ng·mL-1(P<0.05)，盐度S5 组PRL 表达量最高为1.23 ng·mL-1(P<0.05)。

图3 低盐胁迫对梭鱼幼鱼血清PRL 浓度的影响Fig.3 Effect of low salt stress on serum PRL concentration of L.haematocheila

和PRL 变化趋势类似，低盐胁迫下梭鱼幼鱼鳃NKA 活性的变化随着盐度上升也呈现出先下降后上升的趋势，在S15 组NKA 活性最低为1.37 μmol Pi·mg-1prot·h-1(P<0.05)，盐度0 组其值最高为1.831 37 μmol Pi·mg-1prot·h-1(P<0.05)。

图4 低盐胁迫对梭鱼幼鱼鳃NKA 浓度的影响Fig.4 Effect of low salt stress on gill NKA concentration of L.haematocheila

2.3 梭鱼幼鱼非特异性免疫酶类对低盐胁迫的响应

不同盐度低盐胁迫对梭鱼幼鱼SOD 活力的影响如图5。结果显示，整体变化趋势呈现“U”型的规律。超氧化物歧化酶SOD 在盐度15 组内含量最低为11.56 U·mg-1prot，与S10 组差异不显著(P＞0.05)，但显著低于其他各组(P<0.05)。盐度0 组具有最高的SOD 活性，其值为18.62 U·mg-1prot，为盐度15 组的1.61 倍。

图5 低盐胁迫对梭鱼幼鱼肝脏SOD 浓度的影响Fig.5 Effect of low salt stress on liver SOD concentration of L.haematocheila

不同盐度低盐胁迫对梭鱼幼鱼CAT 活力的影响如图6。梭鱼幼鱼肝脏CAT 浓度在S5、S10、S15 组中差异不显著(P＞0.05)，S0 和S25 两组间也不具有显著差异(P＞0.05)，其最低值位于盐度15 组为3.81 U·mg-1prot，最高值位于盐度0 组为4.72 U·mg-1prot，最高值较最低值多了61.07%。

图6 低盐胁迫对梭鱼幼鱼肝脏CAT 浓度的影响Fig.6 Effect of low salt stress on liver CAT concentration of L.haematocheila

不同盐度低盐胁迫对梭鱼幼鱼MDA 活力的影响如图7，随着盐度的上升整体呈现先下降后上升的趋势，各组间差异均显著(P<0.05)，其中S15 组中梭鱼幼鱼MDA 活力最低为0.58 nmol·mg-1prot，仅为S0 组的1/4。

图7 低盐胁迫对梭鱼幼鱼肝脏MDA 浓度的影响Fig.7 Effect of low salt stress on liver MDA concentration of L.haematocheila

不同盐度低盐胁迫对梭鱼幼鱼AKP 活力的影响如图8，随着盐度的升高AKP 活性总体呈现先上升后降低的趋势，其中S15 组AKP 活性最高为1.69 金氏单位·g-1prot(P<0.05)，而S0 组活性最低为1.12 金氏单位·g-1prot(P<0.05)，最大值为最小值的150.89%。

图8 低盐胁迫对梭鱼幼鱼脾脏AKP 浓度的影响Fig.8 Effect of low salt stress on spleen AKP concentration of L.haematocheila

3 讨论

3.1 盐度对梭鱼幼鱼生长的影响

盐度对鱼类生长的影响是通过影响鱼体能量分配所致。以往研究表明鱼类个体需要一定的能量进行渗透压的调节[9]，生活在等渗环境中中的个体能够节省这一部分能量用于生长，因此养殖在等渗环境中的鱼体会具有较高的增重率和饵料转化率[10]。本实验结果表明，盐度15 组梭鱼幼鱼具有最高的特定生长率以及最低的饵料系数，推测盐度15 应该处于梭鱼幼鱼等渗点附近。这与莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus[11]、黄锡鲷Sparus sarba[12]及龙虎斑[13]的研究结果基本一致。同时，本研究所得到的这一结果符合KINNE[14]认为大部分近岸鱼类体液渗透压在盐度10～20 之间的观点。此外，在本实验中虽然S0 盐度组生长受到明显抑制，但实验期间该组成活率高达98.7%，这说明梭鱼这一广盐性鱼类对盐度具有较广耐受范围的特性。但税春等[15]报道梭鱼幼鱼在盐度0.8 存活率只有84.00%，推测其实验结果与其低盐驯化方式或者养殖时除盐度外其它环境因子的干扰有关[16]。

3.2 梭鱼幼鱼渗透调节生理机制对低盐胁迫的响应

GH，COR，PRL 同为鱼类盐度适应过程中渗透调节的重要激素，本实验的结果显示，梭鱼幼鱼对盐度变化较为敏感，低盐胁迫时下丘脑－垂体－肾间组织轴(HPI 轴)及下丘脑-垂体-肝脏生长轴(GH/IGF-I)做出相应的反应，具体表现为GH、COR 随着盐度的降低而降低，这与施氏鲟Acipenser schrenckii[17]、斜带石斑鱼Epinephelus coioides[18]的渗透调节激素对盐度胁迫的相应结果一致，说明GH 和COR 在梭鱼幼鱼适应盐度变化时，都表现为高盐适应激素且具有协同作用。与GH 同为垂体多肽激素的PRL 随盐度的降低而升高，表现为低盐适应激素，与对银鲳Pampus argenteus[19]的研究结果类似。

NKA 参与细胞内外Na＋/K＋的跨膜主动转运，提供离子转运的根本动力，因其在体液和细胞内液之间的渗透压调节中起到重要的作用，所以可作为判断鱼体离子转运能力的指标[20]。在本研究中，各盐度组梭鱼幼鱼鳃丝NKA 活性随盐度的呈“U”型趋势，在盐度15 组有最低值，这与对斜带石斑鱼[21]、鲻鱼Mugil cephalus[22]、褐牙鲆Paralichthys olivaceus[23]等大多数广盐性鱼类在等渗点附近NKA 活性最低的研究结果一致。在渗透相关激素的共同作用下，盐度15～25 范围内，NKA 活性随盐度降低而降低，而S0 组NKA 活性高于对照组，是因为当盐度降低到一定程度时，NKA 活性会增加以吸收外界环境中的离子来维持体内的渗透压，余德光等[24]对斜带石斑鱼的研究也存在类似的结果。除此之外，已有研究显示，细胞消耗总ATP的1/3 用于维持细胞内高K+低Na+的离子环境，而在偏离等渗点盐度水体的黑鲷幼鱼具有高NKA 活性，说明了偏离等渗点盐度会增加渗透调节所需能量，这与前文中S15 组具有最高的特定生长率以及最低的饵料系数相符合。

3.3 梭鱼幼鱼抗氧化酶及非特异性免疫酶对低盐胁迫的响应

盐度胁迫会引起鱼体多种生理应激反应，从而产生氧化应激[25]，肝脏为鱼类代谢的主要器官且为储存多不饱和脂肪酸的重要组织[26]，在已有研究中，鱼体抗氧化酶活性的升高，可以显示鱼体内有大量的ROS以待清除[27]。在本实验中，盐度0 组梭鱼幼鱼肝脏SOD 活性显著升高，表明其在生境盐度变化的情况下，抗氧化防御系统做出响应，以提高抗氧化酶活性来维持鱼体的稳态，这与对褐牙鲆[23]幼鱼的研究结果相类似。而CAT 活性随着盐度的降低与SOD 有着类似的趋势。这说明在梭鱼幼鱼体内抗氧化酶在应对低盐胁迫时相互协调共同作用，这与对低盐胁迫下银鲳[28]的抗氧化酶活性研究结果相类似。在本研究中，盐度15组的SOD、CAT 活性及MDA 浓度均为最低，这可能与盐度15 组最接近梭鱼幼鱼等渗点有关，因此在此盐度下梭鱼幼鱼呼吸代谢程度降低，活性氧产生较少，故较低活性的SOD、CAT 及MDA 活性即可维持幼鱼健康状态，这与对多鳞四指马鲅Eleutheronema rhadinum[29]幼鱼的研究相一致。盐度0 组肝脏SOD、CAT 及MDA 浓度皆为最高，且显著高于对照组，这说明虽然梭鱼幼鱼在淡水中仍能存活，但低盐已对鱼体的非特异性免疫造成极大的影响，这也能是S0 组生长受到抑制的内在原因之一。

盐度变化时，因消耗能量维持内环境稳态，外源性病原会更易侵入鱼体，导致爆发疾病的概率增加。碱性磷酸酶AKP 属鱼类非特异性免疫系统，在维持鱼体健康稳态中起到重要作用[30]。

本研究结果表明盐度15 组AKP 活性最高，对照组次之，而更低盐度组AKP 活性皆受到抑制，且随着盐度的降低其AKP 浓度也随之降低。盐度15 最接近梭鱼幼鱼的等渗点，这与低盐胁迫下梭鱼幼鱼的生长及摄食情况存在正相关，同时对日本鳗鲡Anguilla japonica[31]、暗纹东方鲀Takifugu obscurus[32]等众多研究也存在类似的结果。崔前进等[6]对钝吻黄盖鲽Pseudopleuronectes yokohamae 低盐胁迫的研究结果认为，适当降低盐度可以提升AKP 活性，可以提高鱼体免疫力，而盐度降低到一定程度机体的免疫状态则会受到抑制，这与本文的研究结果一致。