Wnt5a基因与AECOPD患者中医证型相关性研究＊

杨思情，周 进

（1.贵州中医药大学第一附属医院 贵阳 550002；2.秦皇岛市中医医院 秦皇岛 066000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种常见病、多发病，其以进行性发展的不可逆的气流受限为主要特征；据世界卫生组织调查显示COPD目前已成为世界第四大致死性疾病，据“全球疾病负担研究项目（The Global Burden of Disease Study）”评估，到2020年，慢性阻塞性肺疾病将成为第三大致死性疾病[1]。2014年中国流调数据显示目前该病的发病率为8.2%[2]，该病主要的病因有吸烟、职业粉尘、大气污染、感染等。从病理上讲，COPD以肺气肿和慢性支气管炎为主要病理特征[3]。在其病程发展过程中气道重塑为其关键的病理改变；气道平滑肌细胞和成纤维细胞可能参与其过程[4-5]，葛正行等[6,8]通过动物研究证实了Wnt/β-catenin信号途径参与了气道成纤维细胞的增殖过程。但是，尚未有研究报导Wnt5a基因与AECOPD患者中医证型的关系，因此本研究希望通过检测慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血中Wnt5a基因表达量，并分析其与部分中医证型的关系，为中医证型诊断提供客观依据。

1 资料及方法

表1 不同组别临床基线资料比较

表2 肺胀证型诊断标准

1.1 实验对象及分组

本研究的实验对象为50例病例，按普通高等教育“十一五”规划教材田德禄等主编的《中医内科学》肺胀证型诊断标准，将患者分为痰浊壅肺证、痰热郁肺证、肺肾气虚、痰蒙神巧、阳虚水泛证共五组，其中痰浊壅肺证、痰热郁肺证、肺肾气虚三组各15例，痰蒙神巧2例，阳虚水泛3例，正常组15人，年龄40-90岁；因痰蒙神巧及阳虚水泛组病例数较少，没有统计学意义，故目前本实验仅讨论痰浊壅肺证、痰热郁肺证、肺肾气虚三组及正常组。AECOPD患者肺功能分级中GOLD1 8例、GOLD2 15例、GOLD 3 17例、GOLD4 10例，其中痰浊壅肺证组GOLD1-4级病例数为3例、5例、5例、2例痰热郁肺证组GOLD1-4级病例数分别为3例、6例、4例、2例，肺肾气虚组GOLD1-4级病例数分别为2例、4例、6例、3例，痰蒙神巧GOLD1-4级病例数分别为0例、0例、1例、1例，阳虚水泛组GOLD1-4级病例数分别为0例、0例、1例、2例，见表1。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

本研究参照《慢性阻塞性肺疾病全球防治倡议（GOLD）2017版》[1]及《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识》（2017年更新版）[2]，拟定西医诊断标准为：①既往明确诊断为COPD；②咳、痰、喘，呼吸困难加重，或者咯脓性痰液,并且需要调整原有治疗方案方能控制病情；③除前述两者外，其他引起上述临床表现的疾病。

1.2.2 中医诊断标准

按普通高等教育“十一五”规划教材田德禄等主编的《中医内科学》肺胀证型诊断标准，具体如表2。

1.3 纳入标准

本研究纳入标准：符合AECOPD西医诊断标准；符合肺胀中医证型诊断标准；自愿参与本实验研究并签署知情同意书；无其他系统严重疾病。

1.4 排除标准

本研究排除标准：合并心脑血管等系统疾病；近一月使用全身糖皮质激素治疗者；合并有支气管扩张、支气管哮喘、肺间质疾病、肺结核、弥漫性支气管炎等；合并各个系统肿瘤者；不能合作及不能完成肺功能检查者。

1.5 中医辨证质量控制

中医辨证由贵阳中医学院第一附属医院（国家级三级甲等中医院）三名国家级名老中医完成，使中医证型更加准确。

2 实验方法

2.1 标本采集、处置及总RNA提取

四组均空腹条件下抽取静脉血液，将血液样本置于离心机中以3000 r/min离心5分钟。此时可见样本分为三层：上层血清、中层有核细胞、下层红细胞。取中间有核细胞层置于一新的去RNA酶1.5 mL EP管中，按1∶3（250µL样本加入750µL TRIGene总RNA提取液）的体积量加入TRIGene总RNA提取液。

2.2 RNA完整性鉴定

采用琼脂糖凝胶电泳法测定总RNA质量：称取0.5 g琼脂糖干粉置于三角烧杯中，加入1X TBE Buffer 5 mL，搅匀，置于微波炉中，中火加热2分钟，室温冷却至40℃-50℃后加入10µL GoldviewⅠ混匀。插好梳子后将其缓慢由一角倒入干净电泳胶槽中，待其完全凝固后拔梳备用。吸取3µL总RNA液置于规格为0.2 mL的去酶EP管中，加入3µL 5 x loading buffer，充分混匀后吸出混合液加入点样孔中，最后一排加入DNA marker以作比较。在电压为120 mv，电流为80 mA环境下进行水平电泳15分钟（负极到正极）。采用UVP系统，在312波长光下观察并记入结果，选取总RNA质量好的样品进行逆转录。

2.3 cDNA合成

将总RNA置于冰上解冻，并用DEPC-ddH2O配成终浓度为200 ng/µL的稀释液。根据试剂盒提供的逆转录体系说明，将除总RNA外的试剂于冰上预混。具体如表3。

将预混液以16µL/管的剂量加入规格为0.2 mL去酶EP管中，并在每管中加入4µL浓度为200 ng/µL的总RNA稀释液，构建20µL完整逆转录体系。将上述逆转录体系于普通PCR仪中进行逆转录，反应温度设定为37℃逆转录15分钟；85℃加热5秒使逆转录酶失活；取出cDNA，加入60µL DEPC-ddH2O将产物稀释4倍进行扩增。

2.4 Real-Time PCR扩增反应

2.4.1 引物设计与合成

引物设计与合成，根据基因库设计并合成人βactin、Wnt5a，具体如表4。

2.4.2 RT-PCR扩增体系配置

RT-PCR扩增体系配置，采用SYBR Green分析法进行Real-Time PCR，扩增体系如表5。

2.4.3 RT-PCR反应程序设定

RT-PCR反应程序设定，将上述体系反应液加入八连管中，盖紧盖子，将其置于ABI 7500 PCR仪中采用两步法扩增。反应终止后采用ABI 7500软件分析相关数据。

表3 逆转录体系预混试剂表

表4 引物表

表5 Real-Time PCR扩增体系表

3 数据分析

采用统计软件SPSS19.0进行数据统计学分析，采用均数±标准差（χˉ±s）表示，各组COPD急性加重期中医证型之间符合正态分布采用采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两组间比较采用LSD法检验。不符合正态分布采用非参数检验，P＜0.05差异具有统计学意义，P＜0.01差异具有显著统计学意义。

4 结果

4.1 各组间肺功能受损程度比较

肺功能GOLD1～4分级比较，痰浊壅肺组肺分别为3例、5例、5例、2例；痰热郁肺组为3例、6例、4例、2例；肺肾气虚组分别为2例、4例、6例、3例。各组换则会肺功能受损程度比较差异无统计学意义（Chi-SquareTest，χ2=1.336，P=0.97），见表6。

4.2 不同证型血液总RNA完整性检测

各组血液总RNA在电泳后成像表现为三条光亮带，其中明亮的28 s带大约为18 s带的两倍，最前面的为5 s条带，三条带周围未见其他杂带及拖尾现象，说明提取的总RNA质量良好，无蛋白及DNA污染，无RNA降解

表6 各组患者在肺功能受损程度上的比较（Chi-Square Test）

图1 各组血液总RNA在电泳后成像

图2 Wnt5a基因熔解曲线

图3 Wnt5a基因扩增曲线

4.3 Wnt5a基因扩增曲线图

各指标中没有引物二聚体以及非特异性扩增高峰的出现，说明引物设计合理，特异性较高。

4.4 Wnt5a基因的mRNA在不同中医证型中相对表达量情况

图4 β-actin基因熔解曲线

图5 β-actin基因扩增曲线

表7 Wnt5a基因的mRNA相对表达量（）

表7 Wnt5a基因的mRNA相对表达量（）

组别正常组痰浊壅肺痰热郁肺肺肾气虚例数15 15 15 15 Wnt5a基因表达量（2-ΔΔct）1±0.05 1.45±0.54 1.70±0.71 2.11±0.92

图6 各种证型Wnt5a基因的表达量

如表7、图6所示，正常组基因表达量为1±0.05、痰浊壅肺组表达量为1.45±0.54、痰热郁肺组为1.70±0.71、肺肾气虚组表达量为2.11±0.92，可见随着病情的家中，Wnt5a基因的mRNA也随之升高。与正常组相比，痰浊壅肺组、痰热郁肺组、肺肾气虚组中Wnt5a基因的表达量明显增高（P＜0.01）；组间比较：三组之间存在明显差异，且表达量：痰浊壅肺＜痰热郁肺＜肺肾气虚（P＜0.01）。

4.5 Wnt5a基因与AECOPD中医证型相关系数情况

运用线性回归Kendall相关系数和Spearman相关系数分析，Wnt5a基因的mRNA相对表达量与AECOPD中医证型相关性研究（Kendall相关系数r=0.779和Spearman相关系数r=0.856，P=0.000＜0.01），具有显著统计学意义，表明Wnt5a基因mRNA相对表达量与AECOPD中医证型之间存在直线线性相关关系，且呈正性相关。见表8。

5 讨论

COPD是一种气流受限不完全可逆呈进行性发展的可以预防和治疗的疾病，气道重建是COPD病理进展的关键[9-10]。葛正行教授等[11]研究发现，Wnt信号通路在COPD大鼠及患者气道重塑的过程中起到重要作用。Wnt5a信号通路是Wnt信号通路中的非经典通路[12]，激活该通道的关键蛋白主要有Wnt11等。有研究证明，在肺间质纤维化疾病中Wnt5a参与其纤维化过程[13-15]；哮喘大鼠肺组织中Wnt5a增高并与TGF-β1呈正相关关系[16]，提示其可能影响气道纤维化而促进气道重塑，袁霞等[17]发现COPD模型大鼠肺成纤维细胞中Wnt5a表达量增高，提示其可能通过促进成纤维细胞增生参与气道重塑。本研究通过检测AECOPD患者外周血中Wnt5a基因及蛋白表达量，发现与正常组相比其他组表达量明显较低，这提示Wnt5a信号通路可能在COPD气道重塑过程中扮演着重要角色。

AECOP在中医归属于“喘证”或者“肺胀病”范畴，其主要临床特征为咳、痰、喘、闷、满。中医将其分为痰浊壅肺、痰热郁肺、痰蒙神窍、肺肾气虚、阳虚水泛五个证型，现代中医学者多从痰、瘀、虚、气滞等方面对其进行辨证论治，本次研究发现，AECOPD患者中痰浊壅肺、痰热郁肺、肺肾气虚三个证型Wnt5a基因mRNA的表达量均高于正常组，三组之间比较，P＜0.01，差异具有显著统计学意义，且肺肾气虚组与痰浊壅肺证和痰热郁肺证组分别比较，P均＜0.01。AECOPD患者发病早期病理性质多为本虚标实，日久疾病反复迁延不愈，正气虚损。本次研究发现，随着患者病情的加重，Wnt5a基因mRNA的表达量也逐渐增加，且通过线性回归Kendall相关系数和Spearman相关系数分析后发现（Kendall相关系数r=0.779和Spearman相关系数r=0.856，P=0.000＜0.01），具有显著统计学意义，表明Wnt5a基因mRNA相对表达量与AECOPD中医证型之间存在直线线性相关关系，且呈正性相关。提示Wnt5a基因的表达量可以随病人病程的延长及病情的加重其活化的程度也越来越高。

表8 三种证型的Wnt5a

基于上述论述，本研究猜想Wnt5a基因在患者血液中的表达可以作为中医诊断AECOPD证型的客观指标之一，但是本研究由于痰蒙神窍及阳虚水泛组病人较少，故未能完整地探讨该基因与完整中医证型的关系。