基于网络药理学探讨血必净注射液治疗新型冠状病毒肺炎机制＊

孔 艺，林莉莉，陈 永，赖 莎，吴红卫，陈吉生

（广东药科大学附属第一医院药学部 广州 510080）

2019年12月，武汉市爆发了由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。COVID-19具有传播迅速广泛、传染性强、各类人群普遍易感的特点，轻症患者出现发热、乏力、干咳等症状，严重者可出现呼吸困难、呼吸窘迫综合征或脓毒症休克等，临床尚无针对性的特效药物[1-3]。截至2020年3月19日，全球COVID-19病例已超过20万，有8000多例死亡。我国首次报告无新增本土病例，这是一个惊人的成就[4]。

2020年2月20日，国家中医药管理局党组书记、副局长余艳红表示，坚持中医药治疗COVID-19取得显著成效。截至2020年3月22日，国家卫生健康委先后发布了七版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，将血必净注射液纳入治疗重型（气营两燔证）和危重型（内闭外脱证）COVID-19方案中[5]。中央指导组专家组成员、东南大学附属中大医院副院长邱海波表示，中药血必净注射剂对新冠肺炎患者效果良好。有相关研究表明，血必净注射液能够对冠状病毒导致的炎症因子风暴或者炎症反应有抑制作用，对新型冠状病毒也有一定的抑制作用[5]。

现代药理学对血必净注射液的研究局限于单一成分和单一靶标，而中药网络药理学这一新领域的研究旨在从系统层次和分子水平揭示中药方剂的奥秘，促进中药研究从当前的“单一靶标，单一药物”模式转向“网络靶标，多成分药物”的新模式。研究结果表明，中药网络药理学能够为中医学从基于经验的医学迈向基于证据的医学提供新的途径，同时改进当前的药物研究策略[7-9]。本研究通过网络药理学分析血必净注射液体内有效成分的潜在作用靶点、作用通路及生物过程等信息，从分子层面阐释其治疗COVID-19的机制。

1 材料与方法

1.1 筛选活性成分和靶蛋白

本研究通过检索国内外文献，筛选血必净注射液在体内外通过LC-MS方法均能定量检测到的化学成分。经Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）验证和转化，然后在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem、TargetNet[10]（http://targetnet.scbdd.com/）和Similarity Ensemble Approach数 据 库（SEA,http://sea.bkslab.org/）获取化合物对应的靶点蛋白，同时使用蛋白质数据库UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）转换为统一基因名称。

1.2 新型冠状病毒肺炎相关靶点搜集

Genecards数据库（https://www.genecards.org/）是一个可提供基因组、蛋白质组、转录、遗传及功能上所有已知人类基因的平台[11]。以“novel coronavirus pneumonia”为关键词，搜集COVID-19相关的靶点信息。将在Genecards数据库中检索得到的冠状病毒靶点与血必净注射液的靶点在Venny 2.1.0中映射筛选出共同靶点，将其作为血必净注射液的抗病毒靶点，导入Cytoscape 3.2.1中构建化合物-抗病毒靶点网络，运用“Network Analyzer”功能分析其拓扑学属性。

1.3 中药-化合物-靶点-疾病网络构建

将血必净注射液活性成分及其相应靶点导入Cytoscape 3.2.1中，构建血必净注射液中药-化合物-靶点-疾病网络，导出其相关的拓扑数据如度值、介数等，并运用“Network Analyzer”功能分析其拓扑学属性。度值和介数是评价一个节点在网络中比重的重要拓扑学参数。度值可反映网络中某节点与其他节点的链接数目，介数反映了网络中所有最短的路径中经过该节点的路径的数目与最短路径总数的比值。

1.4 构建靶点相互作用网络

为明确血必净注射液潜在治疗COVID-19靶点及靶点之间的相互作用，本研究将筛选出的靶点导入STRING网络平台（https://string-db.org/）中构建靶点相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI）。把蛋白种类设置为“Homo sapiens”，将评分条件（置信度）设定＞0.9，采用“Cytohubba”插件对“degree”进行分析，确定血必净注射液治疗COVID-19的核心靶点。

1.5 KEGG信号通路和GO生物过程富集分析

利用Cytoscape中的“ClueGO 2.5.5”插件对“1.2”和“1.3”中得到的血必净注射液核心靶点，进行GO生物过程和KEGG信号通路富集分析。GO富集可了解靶点主要的作用过程，KEGG通路通过观察靶点在通路中的分布情况，可进一步了解该靶点在代谢、信号转导等通路中的作用。以P＜0.05进行靶基因筛选，得到血必净注射液发挥作用的主要信号通路及参与的生物过程。

1.6 构建血必净注射液作用靶点通路图

本研究采用KEGGMapper功能，将选择的活性成分作用靶点在与免疫相关的作用通路上标注出来，验证血必净注射液通过多靶点、多途径抗炎的作用机制。

2 结果

2.1 血必净注射液候选化合物和对应人类靶点筛选结果

通过检索国内外文献[12-22]，筛选出血必净注射液中和体内均能定量检测到的36个主要活性成分（表1）。其中，红花有5个化学成分，赤芍10个化学成分，丹参13个化学成分，当归1个化学成分，川芎和当归共有2个化学成分，丹参和红花共有3个化学成分，丹参和当归共有2个化学成分。本研究采用TCMSP、PubChem、TargetNet和SEA数据库预测靶点，并经Uniprot校正后共获得447个靶点。

2.2 构建中药-化合物-靶点-疾病网络

以“novel coronavirus pneumonia”为关键词，在Genecards数据库中挖掘出与COVID-19相关靶点259个。将血必净注射液的447个作用靶点与259个COVID-19相关靶点在Venny 2.1.0中映射得出70个共同靶点，将候选化合物与70个靶蛋白导入Cytoscape软件，去除与靶点无交集的孤立成分，绘制网络图（图1），网络中共有94个节点（其中24个化合物节点及70个靶蛋白节点）和222条边。每个候选化合物平均作用于2.917（70／24）个靶点，而每个靶蛋白平均连接药物的数量为3.171（222／70），说明了血必净注射液是通过多成分-多靶点整体发挥作用。结合网络拓扑学分析，该网络图的网络集中度为0.432、网络密度为0.051、网络异质性为1.320、最短路径为8742。节点的度值（Degree）和介值中心度（Betweenness Centrality）是描述网络节点重要性的常用指标[23]。在图1中，节点的平均度值为4.7234，大于该平均度值的节点有30个；节点平均介值中心度为0.020463，大于该平均介值中心度的节点有22个。共有21个节点的度值和介值中心度均高于均值（见表2），其中化合物有10个，靶蛋白有11个。化合物分别为槲皮素（A3）、没食子酸（A11）、木犀草素（A32）、迷迭香酸（A28）、芦丁（A33）、山萘酚（A2）、绿原酸（A34）、丹参酮IIa（A19）、羟基红花黄色素A（A1）和芍药苷（A5）。靶蛋白分别是

表1 血必净注射液中有效化学组分

PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、HMOX1、MAPK1、IL6、NOS2、NOS3和PPARG。

图1 中药-化合物-靶点-疾病网络图

表2 血必净注射液成分-靶点网络关键节点及其拓扑学特征

2.3 构建PPI网络

为更好地探讨血必净注射液的作用机制，将血必净注射液70个新型冠状病毒肺炎相关靶点蛋白输入STRING数据库，构建靶蛋白相互作用PPI网络（图2）。该网络共有68个节点，222条相互作用关系，平均度值为6.53。将在STRING平台中构建的PPI网络数据导入Cytoscape 3.2.1中，利用Cytohubba插件中的Degree降序排列筛选出大于平均度值的核心靶点24个，图3为排名前十的核心靶点。

2.4 GO生物过程分析

综合2.2和2.3中所得到的32个（其中IL6、RELA和MAPK1重复）血必净注射液关键靶点，进行GO生物过程富集分析，筛选出P＜0.05的生物过程91个。利用Cytoscape插件“ClueGo”得出GO生物过程富集分析的可视化结果，如图4所示。涉及细胞因子活性、脂多糖细胞应答、细胞因子生物合成过程调控和神经炎症反应调节等生物过程，这些通路即是血必净注射液重要靶标干预的生物学过程。

2.5 KEGG信号通路富集分析

对32个血必净注射液关键靶点进行KEGG信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路110条，利用Cytoscape插件“ClueGo”得出KEGG分析的可视化结果，如图5所示，涉及IL-17信号通路、甲型流感、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性肠病等通路。图6为血必净注射液活性成分对IL-17信号通路作用靶点标注图。

3 讨论

图2 血必净注射液相关靶点的PPI网络图

图3 血必净注射液核心靶点

血必净由红花、赤芍、川芎、丹参和当归组成，红花中的黄酮类化合物、赤芍中的单萜苷类、川芎/当归苯并呋喃酮类和丹参中的儿茶酚类化合物在XBJI中发挥重要作用，并于2004年批准为国家二类新药，是我国唯一被批准治疗脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的中成药[24-25]。一项发表于国际重症医学权威期刊Critical Care Medicine的研究表明，血必净注射液具有降低重症肺炎病死率的临床价值[26]。但因成分复杂，其具体药效成分、药理作用尚无法准确阐明。

从网络药理学分析结果可知，血必净注射液有效成分综合评分最高的10个化合物分别属于黄酮类、酚酸类、菲醌类、查尔酮苷类和单萜苷类，提示其是血必净注射液发挥疗效的重要活性成分。此外，血必净注射液治疗COVID-19可能与PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、MAPK1、IL2、IL6和IL10靶点有关，这些靶点都在炎症的病理过程中起重要作用。COVID-19的严重程度与病毒和机体炎症反应的强度相关，如患者体内出现过度的炎症反应，即“细胞因子风暴（cytokine storm）”，将可能导致严重的后果甚至死亡。武汉金银潭医院一项发表于The Lancet的临床研究[27]发现，重症患者血浆中IL2，IL7，IL10，GSCF，IP10（CXCL10），MCP1(CCL2)，MIP1A(CCL3)和TNFα显著高于非重症患者。血必净注射液主要通过抑制血清中IL6、TNFα、MCP1，MIP2和IL10减轻炎症反应。另一方面，有研究认为[29]，SARS-CoV-2与SARS-CoV两种病毒感染的途径均通过其表达的S-蛋白与人体内血管紧张素转化酶（ACE2）结合，导致病毒侵入机体而致病。冠状病毒的3CL水解酶（也称Main proteinase，Mpro）通过对pp1a（相对分子质量486 000）和pp1ab（相对分子质量790 000）2种多聚蛋白复制酶泛水解，在介导病毒复制和转录功能中发挥关键作用，是治疗SARS和其他冠状病毒的理想靶点[30-31]。更重要的是，槲皮素、木犀草素和山柰酚与ACE2和SARS-CoV-2 3CL水解酶均具有良好的结合能力[32-34]。以上结果说明，血必净注射液不仅可通过调控炎症通路，还可能通过抑制病毒入侵和复制，发挥治疗COVID-19的作用，体现了血必净注射液多成分、多靶点协同作用的特点。

图4 GO生物过程分析

图5 KEGG信号通路富集分析

图6 血必净注射液活性成分在免疫相关通路中的作用靶点标注图

进一步分析血必净注射液GO生物过程和KEGG信号通路富集结果，本研究通过GO生物过程富集分析发现血必净注射液靶点主要涉及细胞因子活性、脂多糖细胞应答、细胞因子生物合成过程调控和神经炎症反应调节等生物过程。KEGG信号通路富集在IL17信号通路、甲型流感病毒、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性肠病等通路。SARS-CoV-2感染导致强烈的免疫反应和炎症风暴，此过程中大量细胞因子被激活，与SARS-CoV相似。特别地，Th17细胞的主要功能是促进中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎症反应，一系列细胞因子如TGFB、IL6、IL9、IL1、IL23、IL21、IRF4、STAT3参与了Th17细胞分化过程。血必净注射液的多通路可能通过调控免疫和炎症相关的信号通路，起到抑制活化的细胞因子、缓和过激的免疫反应、消除炎症的作用。

综上所述，血必净注射液的调控过程除了针对SARS-CoV-2结构上的3CL水解酶，更注重在病毒入侵后对宿主自身免疫抗感染能力的调控和干预。因此，血必净注射液通过多成分、多靶点和多通路的共同作用治疗COVID-19。鉴于网络药理学的局限性，后期还将对通路进行验证，为血必净注射液治疗COVID-19提供实验依据。