肝巨噬细胞靶向治疗脂肪性肝病及相关肝癌的机遇与挑战

牛春燕， 赵向阳

1 西安医学院第一附属医院 消化内科， 西安 710077；2 南京市溧水区人民医院(东南大学附属中大医院溧水分院)消化内科， 南京 211200

近年来，免疫微环境的作用被逐渐重视，作为肝脏免疫细胞的重要组分，肝巨噬细胞在各类疾病发病机制中的核心作用及其靶向治疗受到关注。巨噬细胞在体内广泛分布，90%常驻于肝脏，是天然免疫系统的第一道防线，在生理环境下识别、清除坏死或凋亡的细胞碎片和病原体、呈递抗原，参与适应性免疫和免疫监视，起到“哨兵”作用，通过分泌抗炎细胞因子(如IL-10)而形成抗炎微环境、维持免疫稳态；在病理状态(如感染、损伤)下，激活的巨噬细胞产生和释放大量炎性因子和细胞因子，并募集其他免疫细胞到局部参与抗感染或组织修复[1]。近年来对肝巨噬细胞在脂肪性肝病中的作用的研究，为开发靶向治疗提供了机遇。

1 肝巨噬细胞

肝脏中有丰富的巨噬细胞，每100个肝脏细胞中即有20～40个巨噬细胞。肝巨噬细胞按照来源主要分为两大类，卵黄囊来源的固有巨噬细胞即Kupffer细胞及外周血单核细胞来源的浸润型巨噬细胞(monocyte-derived macrophage, MoMF)。

Kupffer细胞是最大的组织常驻型、组织特异性高效巨噬细胞群，具有高度的自我更新、异质性、非移行性和可塑性，可识别、吞噬并降解细胞碎片、外来物质和抗原，并且呈递抗原[2]，在肝脏炎症的启动、延续和修复以及启动固有和获得性免疫反应中起到核心作用。在不同病理情况下，巨噬细胞可以被极化成具有不同表型、功能的两种类型，M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)，M1型主要由干扰素γ和脂多糖(LPS)激活，主要功能包括促炎、杀菌、抗肿瘤、释放促炎因子(如TNFα、IL-1、IL-6、IL-12等)，M2型通过分泌细胞因子(IL-10、IL-4/IL-13、TGFβ等)下调炎症反应和促进组织修复，基于诱导激活物不同M2型可被进一步分为4种亚型：M2a(由IL-4和IL-13诱导)、M2b(由免疫复合物诱导)、M2c(由IL-10、TGFβ和糖皮质激素诱导)、M2d[由IL-6、Toll样受体(TLR)配体和腺苷诱导][3]。

MoMF主要通过趋化因子CCR2、C-C基序配体2(CCL2)或单核细胞趋化蛋白1募集进入肝脏，分为Ly-6Chigh(Ly-6C+)型(引起器官损伤)及Ly-6Clow(Ly-6C-)型(促进器官修复)[4]。

2 肝巨噬细胞与脂肪性肝病及相关肝癌

2.1 肝巨噬细胞与酒精性肝病(ALD) ALD可由酒精性脂肪肝逐渐进展为酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化。在ALD进展过程中，肝内M1、M2表型Kupffer细胞以及相关炎症基因、M1/M2标志物、细胞因子、趋化因子表达均显著增加[5]，单核巨噬细胞聚集增加，可能与急慢性ALD时肠道通透性增加和门静脉高水平内毒素、LPS导致Kupffer细胞过度激活有关[6]。激活Kupffer细胞、肝星状细胞(HSC)、肝窦内皮细胞内的TLR4信号通路可促进血管生成和纤维化形成，导致肝纤维化。因此，TLR途径和LPS介导的损伤，包括内质网激活，可能是开发治疗ALD的潜在新靶点。

2.2 肝巨噬细胞与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 肝脏脂质过度积聚导致的脂毒性诱导了肝损伤的发生。低密度脂蛋白胆固醇在肝细胞脂滴膜上形成胆固醇晶体并激活THP1巨噬细胞从而上调TNFα、炎症小体蛋白3(NLRP3)和IL-1β mRNA，胆固醇晶体可激活暴露于LPS的Kupffer细胞内的NLRP，因此通过溶解胆固醇和分散Kupffer细胞的结构降低胆固醇水平可使非酒精性脂肪性肝炎(NASH)缓解[1]。由肠道通透性、肝细胞脂性凋亡、肠道菌群、游离脂肪酸、胆固醇等增加导致的内毒素和细菌成分释放，诱导了巨噬细胞的活化。Kupffer细胞和MoMF分泌的炎性细胞因子(如IL-1β、TNFα 和CCL2)作为成脂因子可促进NAFLD向NASH的发生及发展。最新一项研究[6]表明，大肠杆菌-LPS可通过TLR4途径诱导巨噬细胞和血小板活化而加重NAFLD的肝损伤。NASH时受损肝细胞释放的外泌体/胞外囊泡中含有线粒体DNA，Kupffer细胞可通过TLR9识别线粒体DNA而加重肝损伤的严重程度。巨噬细胞可依代谢微环境改变而易其表型，提示其在NAFLD中存在代谢重编程[7]。进展期NASH中的肝巨噬细胞聚集并呈现明显的炎症表型，这是NASH进展的一个特征。炎性巨噬细胞可通过几种机制促进NASH进展：影响肝细胞脂肪变、吸引炎性淋巴细胞、刺激血管形成或促进肝纤维化。最新研究[8]发现一种NASH相关巨噬细胞，显著表达骨髓细胞2上高水平的触发受体，这是小鼠和人类NASH的一个特征，与疾病严重程度有关，而且对药理学和饮食干预有应答；同时也证实了巨噬细胞(或其他非实质细胞)的重新编程。

2.3 肝巨噬细胞与纤维化 在肝损伤时，Kupffer细胞产生细胞因子，并通过分泌CCL2和CCL5使大量单核细胞向肝脏募集，后者分化为炎性巨噬细胞并释放细胞因子、吸引其他免疫细胞如自然杀伤细胞，MoMF的数量可达到3～5倍，除了通过释放TGFβ、IL-1β、血小板衍生生长因子(PDGF)和CCL2而促进纤维化外，还介导HSC活化、转分化为可分泌TGFβ1和PDGF-bb的成纤维细胞。炎性和促纤维化巨噬细胞的募集依赖于CCL2-CCR2，CCL2、CCR2基因缺失或药物抑制CCL2可减轻鼠的肝纤维化[9]。近期两项临床Ⅱ期试验[10-11]应用凋亡信号调节激酶1(ASK1)的特异性抑制剂selonsertib或双向CCR2/CCR5 抑制剂cenicriviroc治疗NASH及纤维化患者，以巨噬细胞不同作用为靶向，观察到抗纤维化作用。巨噬细胞来源的TGFβ1是最强的促纤维化因子，可导致HSC激活及细胞外基质产生和沉积。具有促纤维化、促炎功能的Ly-6ChighMoMF表型在微环境改变时可转变为抗纤维化、抗炎Ly-6Clow表型，损伤停止/消除、细胞碎片被吞噬，以及自噬激活均可使巨噬细胞诱导为修复性表型，有助于肝纤维化逆转。

2.4 肝巨噬细胞与肝癌 肝巨噬细胞促进形成肿瘤易感微环境，同时对肿瘤和其他基质细胞衍生信号作出反应，主动促进肝癌进展。肿瘤被认为是一种炎症反应，在肿瘤早期M1型巨噬细胞在炎症损伤、再生修复和清除过程中对肿瘤细胞免疫监视同时也刺激肿瘤形成，而肿瘤一旦形成后则表型即由M1转变为M2，普遍表现出较低的抗原提呈和共刺激能力，并促进肿瘤生长、逃逸抗肿瘤免疫。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)起源于循环单核细胞，由CCL2、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子等趋化进入肿瘤微环境，分化成为成熟肝巨噬细胞[12]。在HCC肿瘤微环境中，TAM大部分极化为M2表型，促进肿瘤生长和生存、血管生成、浸润和转移，但也表现出抗肿瘤免疫的作用。TAM释放多种细胞因子、趋化因子和生长因子，其中IL-6和TGFβ促进肿瘤生长，TNFα、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶和IL-6促进肿瘤浸润和转移，TGFβ与IL-10联合作用发挥抗肿瘤免疫反应作用，血管内皮生长因子、表皮生长因子、PDGF和TGFβ诱导血管生成。M2型TAM通过TLR4/信号传导与活化转录因子3信号通路促进肝癌细胞迁移和上皮间质转化，提示TLR4可能是一种新的肿瘤治疗靶点[13]。TAM的数量和巨噬细胞相关标志物与肝细胞癌的进展和不良预后相关[14]。

3 肝巨噬细胞靶向治疗

来自临床前期的研究(有些已处于临床Ⅱ期及Ⅲ期)提供了巨噬细胞和单核细胞靶向治疗在缓解脂肪性肝炎、纤维化、代谢性疾病方面的证据，有望成为个体化治疗的有效候选方案。目前针对肝巨噬细胞的靶向治疗方法主要有三大类(表1)：(1)巨噬细胞极化/重编程的调节；(2)抑制Kupffer细胞活化；(3)抑制单核细胞向肝脏的募集。由于巨噬细胞具有强大的清除能力，因而使用纳米粒子作为靶点使其成为潜在治疗方向。TAM靶向治疗肝细胞癌的方案包括通过消除肿瘤中的TAM减少TAM的数量、阻断MoMF的募集以及重编程TAM使其极化为抗肿瘤表型。

3.1 抑制Kupffer细胞活化和损伤反应 固有巨噬细胞识别肝脏损伤后将启动后续的肝脏炎症级联反应。TLR2、TLR3及TLR4激动剂抑制PRRs可减轻肝脏炎症和级联反应[5]。广谱抗菌药减少细菌异位及TLR4依赖的巨噬细胞激活可减轻脂肪性肝炎、纤维化以及肝癌[15]。通过益生菌、抗生素、粪菌移植或调节胆汁酸组分改善肠屏障、肠道菌群及内毒素血症可能减轻肝脏巨噬细胞激活。同样，靶向NLRP激活的药物也有可能延缓肝内炎症进程[16]。ASK1特异性抑制剂selonsertib可影响巨噬细胞活化，具有强烈的抗纤维化作用，并可改善汇管区炎症、肝细胞凋亡坏死[17]。脂质体包裹亲油性姜黄素和钙三醇均为NF-κB抑制剂，二者可被肝巨噬细胞和树突状细胞摄取，抑制肝脏炎症、脂质堆积和胰岛素抵抗[18]。

表1 肝巨噬细胞的靶向治疗策略

3.2 调节巨噬细胞极化、分化/重编程 巨噬细胞的不同表型具有不同功能，因此，可通过一些手段促进巨噬细胞极化和(或)应用纳米粒子对巨噬细胞选择性重编程，使其从致病性表型转为促进疾病缓解和肝脏再生的恢复性表型。纳米粒子非常小，在巨噬细胞靶向给药中具有优势，可以作为纳米载体用于诊断和靶向给药治疗肝病。纳米粒子被修饰后与靶向细胞结合并在靶点部位释放，可减少巨噬细胞的非特异性摄取、改变免疫细胞的反应性，延长纳米粒子在循环系统中的停留时间、由此降低其毒性。巨噬细胞特别是Kupffer细胞具有很强的清除能力、天然高效及非特异性摄取大部分纳米材料的能力，在靶向治疗肝脏炎症和纤维化中发挥重要作用。Kupffer细胞可被甘露糖受体靶向或被特定的纳米材料激活，极化为促炎表型。小干扰RNA抑制的TNFα经甘露糖修饰后结合纳米粒子，通过巨噬细胞传递途径给药可预防模型鼠急性肝损伤及死亡，地塞米松脂质体可通过诱导巨噬细胞M2型的激活改善模型动物的急慢性肝损伤[19]。脾酪氨酸激酶抑制剂R406可抑制免疫细胞浸润、巨噬细胞激活，从而减轻ALD；使用修饰的纳米粒子转运小分子脾酪氨酸激酶抑制剂R406的高效给药方式可减轻胆碱缺乏饮食诱导的NASH[20]。干扰素基因激活蛋白是经典的天然免疫信号通路调节蛋白，仅在非实质性细胞特别是Kupffer细胞表达，干扰素基因激活蛋白缺陷或使用NF-κB抑制剂预处理可减轻NAFLD并延缓其进展[21]。糖尿病治疗药物利拉鲁肽可提高NAFLD鼠肝脏中Kupffer细胞的M2/M1比值，改善肝脂肪变。

3.3 抑制单核细胞募集 MoMF被Kupffer细胞募集进入肝脏后，放大并维持肝脏炎症，MoMF募集由趋化因子受体CCL2-CCR2 等相互作用而驱动[22]，因此，可通过靶向性减少或干扰趋化因子信号传导而减少MoMF募集的数量。双向CCR2/CCR5抑制剂cenicriviroc可有效阻断CCL2介导的向肝MoMF募集，并具有抗肝肾纤维化作用。CCR2抑制剂propagermanium、CCL5/RANTES抑制剂Maraviroc可减轻肝脂肪变、肝脏炎症、纤维化和NASH的发展。CCL2抑制剂——RNA-适体分子mNOX-E36可抑制早期Ly6C+MoMF的向肝募集并且将Ly6C+MoMF转变为Ly6C-MoMF，从而有利于纤维化的缓解。以上研究提示，CCL/CCR途径参与巨噬细胞的募集，显示出潜在的治疗作用。目前，已有针对该途径的抑制剂被开发用于代谢性疾病(如2型糖尿病)及其并发症(如糖尿病肾病)的研究。MCSF1具有可结晶片段结构，可促进肝巨噬细胞聚集，MCSF1-Fc诱导Kupffer细胞增殖、单核细胞浸润及巨噬细胞分化，从而增强肝损伤的天然免疫[23]。这种方法可能使肝脏疾病或巨噬细胞功能受损阶段的疾病减轻。Tipelukast(MN-001)是一种口服生物可利用的小分子白三烯受体拮抗剂，在临床前期动物实验中显示出抗炎、抗纤维化作用，机制包括：拮抗白三烯受体，抑制前列腺素E(主要为3、4)，抑制5-脂氧合酶，下调炎症基因表达(如CCR2、单核细胞趋化蛋白1)[24]。

3.4 HCC的TAM靶向治疗

3.4.1 耗竭/消除TAM 脂质体是一种人工制备的囊泡，注射后可被巨噬细胞吞噬。它们可以装载于氯膦酸盐(一种用于骨质疏松症的双膦酸盐)，在吞噬脂质体的巨噬细胞内释放后诱导巨噬细胞凋亡。氯膦酸盐包封的脂质体可部分消除TAM，减慢肿瘤生长，不仅肿瘤中TAM总数减少，而且M2型TAM数量也显著减少，因此认为TAM大部分消除后，剩余的TAM经历了表型转换[25]。选择性消除仅有促肿瘤作用、而不是所有具有吞噬功能的巨噬细胞，是TAM靶向治疗面临的挑战。使用巨噬细胞亚群特异性标志物，通过与SPECT或PET示踪剂耦合的纳米体Kupffer细胞特异性或TAM特异性靶点，可完成Kupffer细胞和M2型TAM的特异性成像[26]。需要强调的是TAM在微环境中与其他细胞紧密连接，被消除后其他细胞将在多大程度上补偿它们耗尽后的功能尚不清楚。

3.4.2 抑制MoMF募集 单核细胞浸润是肿瘤微环境中TAM最重要的来源。CCL2和相应的CCL2-CCR2信号轴是抑制单核细胞募集的重要靶点。CCR2拮抗剂可抑制肝细胞癌生长，减少外周血Ly6Chigh炎性单核细胞浸润，继而降低TAM数量，而且减少大部分由M2型TAM产生的细胞因子，剩余的TAM向M1表型转化[14]。多种细胞因子参与吸引单核细胞，因此，靶向某一通路并不能完全消除募集，CCL2-CCR2或双相CCR5/CCR2抑制剂可有效抑制肿瘤生长[27]。TAM在肿瘤微环境中能生存多长时间，以及何时开始抑制单核细胞募集治疗仍有争议。因为不同时期、不同微环境中TAM具有不同甚至相反功能。

3.4.3 TAM的重编程极化 黄芩苷是一种存在于多种药用植物中的天然黄酮，可通过启动TAM，使其重编程为M1样表型，抑制小鼠肝癌的生长。黄芩苷处理的巨噬细胞与肝癌细胞共培养使体外增殖和迁移能力降低[28]。CSF1及其受体CSF-1R调节巨噬细胞的分化和功能，CSF-1R被竞争性阻断后显著延迟小鼠异种移植的肿瘤生长。该化合物在体外抑制了巨噬细胞的增殖，但在体内并未降低巨噬细胞的浸润，基因表达结果显示，肿瘤治疗中的TAM向M1表型发生了极化[29]。

3.4.4 阻断TAM产物的下游效应 TAM是肝细胞癌进展过程中一个重要的旁分泌IL-6来源。在由内质网应激激活的三个未折叠的蛋白反应途径中，最保守的是需要肌醇的酶1α- X 盒结合蛋白 1信号, 该信号通路通过调节IL-6-信号传导与活化转录因子3信号传导通路的激活而促进肝癌细胞增殖。经美国食品药品监督管理局批准的治疗类风湿关节炎的抗IL-6受体抗体tocilizumab可阻断IL-6信号，在体内外均能抑制TAM刺激的肿瘤干细胞活性[30]。

4 巨噬细胞靶向治疗脂肪性肝病及相关肝癌面临的挑战及展望

4.1 挑战 肝巨噬细胞是炎症、纤维化、肝癌发生的重要参与者，是疾病进展的关键因素。导致巨噬细胞募集、损伤反应或分化的中枢通路在动物与人体之间存在较大差异，因此巨噬细胞靶向治疗从实验转化为临床应用尚面临诸多挑战：(1)动物模型与人体的巨噬细胞及其亚群表型、功能存在诸多差异，而且模型仅能反映发病机制的某一特定方面，而人类在一些方面的异质性，导致巨噬细胞功能的更大差异；(2)肝巨噬细胞在不同背景下、甚至在疾病的不同阶段具有迥异的表型和功能，目前的靶向治疗方法仅有利于某一方面而对其他方面则起到不利甚至相反作用，有必要探索适应于不同背景、不同疾病阶段功能的巨噬细胞靶向治疗；(3)减少炎性肝巨噬细胞的治疗性干预有可能引起相反的结果，即增加巨噬细胞的数量和功能，是否会导致或加重严重感染，对于存在严重免疫功能障碍者(如终末期肝病合并高风险致命性感染)是利是弊尚缺乏依据；(4)基于纳米医疗中的脂质体具有理想的费-效比，但可引起剂量依赖性毒性，怎样最大程度降低毒性、增强疗效也是研究中所面临的技术挑战，而且大部分技术尚未在肝脏及巨噬细胞中得到验证。

4.2 展望 由于从药物输送到诊断和成像领域的广泛应用，纳米医学发展迅速，如脂质体和聚合物胶束，已经被批准用于癌症治疗。最新的单细胞RNA测序、多参数组织学分析、系统生物学方法、多对肝脏活检的利用将有助于克服某些技术困难。固体脂质纳米粒在室温和体温下稳定，使药物释放时间延长，并可减少非特异性细胞的摄取，从而降低药物毒性。氧化铈纳米颗粒具有抗氧化，抗炎和抗脂肪变特性，主要积累在肝脏中，影响蛋白质磷酸化，减少巨噬细胞浸润和炎症基因表达，增强肝细胞凋亡活性，减弱其增殖，有望成为新的治疗手段[31]。除趋化因子外，炎性细胞因子也参与改变巨噬细胞的激活和组织募集，如IL-17A轴影响NAFLD肝巨噬细胞募集，应用基因缺失或IL-17受体拮抗剂通过耗竭巨噬细胞可减轻NAFLD及ALD相关肝脂肪变、炎症、纤维化和肝癌[32]。钙黏蛋白-11在肝纤维化过程中增加[33]，提示钙黏蛋白-11可能是巨噬细胞治疗肝纤维化的潜在靶点。除了关注Kupffer细胞的极化/分化调节以外，如何将MoMF由Ly-6Chigh向Ly-6Clow转换可以作为新的研究方向[5]。近期一些研究[34-35]揭示了新的治疗前景，期待在未来转化用于临床。有些问题尚需进一步明确：不同巨噬细胞表型的意义和功能是什么？能否利用重新编程选择性表型巨噬细胞来解决疾病？如何在不影响其他巨噬细胞表型和其他细胞类型功能的情况下诱导疾病消退，从而减少不利影响？