乳酸杆菌对东北酸菜发酵特性的影响解析

李凤姿， 张 媛， 王小垒， 吴 昊， 杨洪岩

（东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040）

东北酸菜是以新鲜白菜为原料，主要依靠乳酸菌发酵获得的地域性家常特色食物，具有香气浓郁、味道鲜美、组织嫩脆、可增进食欲等特点。市场需求的不断扩大推动着酸菜产业化进程的加快，但如今东北酸菜的多数加工企业由于技术缺乏、急于上市等原因仍采用传统的自然发酵方式生产酸菜，并在成品酸菜中添加防腐剂[1]，严重影响着酸菜产品质量及安全性。在酸菜生产中应用人工接种发酵不仅可以控制发酵进程、缩短产品的成熟时间，而且能得到质量稳定的产品，减少防腐剂的使用[2]。应用乳酸菌对酸菜进行接种发酵是未来酸菜生产的必然趋势。

根据发酵类型可以将乳酸菌分为两类：异型发酵乳酸菌和同型发酵乳酸菌。异型发酵乳酸菌在发酵过程中产生乳酸、乙酸、CO2等产物，而同型发酵乳酸菌在发酵过程中主要产生乳酸。接种的乳酸菌种类不同，发酵过程中微生物多样性和生化特性也有所不同。选择从原始产品中分离出的同时是优势菌属的乳酸菌作为接种剂可以更有效地降低发酵失败的风险，得到与自然发酵风味更接近的产品[3-5]。东北酸菜自然发酵过程中占优势的、不同发酵类型的菌株有短乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、寡发酵乳杆菌等[6-7]。在我们之前的研究中发现，向自然酸菜发酵体系中加入同型发酵乳杆菌和异型发酵乳球菌的作用效果不同，乳杆菌对于酸菜发酵起着主导作用[8]。但不同种的乳杆菌对于酸菜发酵进程的影响尚不明确，而这些数据的积累又是筛选高效稳定的酸菜发酵接种剂所必须的。

基于此，本研究筛选异型发酵乳杆菌短乳杆菌、寡发酵乳杆菌和同型发酵乳杆菌弯曲乳杆菌、植物乳杆菌，分别对传统发酵酸菜进行接种，通过生理生化指标和微生物多样性分析探索不同种类乳杆菌对酸菜发酵效果的影响，为筛选高效稳定的酸菜接种剂奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 原料与菌种

白菜：购自黑龙江省绥化市，实验全程为同一品种；菌种：作者所在实验室从自然发酵酸菜样品中分离的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、寡发酵乳杆菌（L.oligofermentans）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）和植物乳杆菌（L.plantarum）。

1.2 仪器与设备

微型pH计：日本Horiba公司产品；紫外分光光度计：北京普析通用仪器；Nanovue：美国GE公司产品；高效液 相色谱 （Highperformanceliquid chromatography，HPLC）：美国Waters公司产品；HPX-87H色谱柱：美国Bio-Rad公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 接种乳酸菌的筛选 从自然发酵的酸菜中分离的10株L.brevis、10株L.oligofermentans、5株L.curvatus、10株L.plantarum中各筛选一株生产迅速、酸积累量多的菌株。具体为：将从-70℃取出经二次活化的L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum单菌落接种于液体MRS葡萄糖培养基中，L.brevis、L.curvatus、L.plantarum于37 ℃培养48 h，L.oligofermentans于25℃培养48 h。每隔8小时使用紫外分光光度计测OD600值；用微量pH计测定菌株培养液的pH值；取10 mL菌株培养液用蒸馏水稀释10倍后，用0.1 mol/L标定后氢氧化钠溶液滴定至pH值为8.3，测定其可滴定酸质量浓度（g/L）[9]。每个处理设3次重复。

1.3.2 发酵 采用传统自然发酵方法[7]，每缸内装约75 kg白菜，加入盐（盐与鲜菜质量比为1∶100）和水，用腌菜石压实。实验设置接L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum和 不 接 菌（对照）的5个处理，菌株接种量为106个/g。酸菜发酵完成时间为30 d，每个处理设3次重复。取样间隔设为发酵的第0、6、12、18、24、30天。

1.3.3 微生物计数及生化指标测定 菌落计数（CFUs）：采用平板梯度稀释法；乳酸菌培养：采用MRS培养基，将稀释的酸菜汁与50℃保温的培养基混合均匀，30℃培养2 d后计数；一般细菌培养：采用营养琼脂培养基，37℃培养2 d后计数。每个处理3次重复。

可溶性糖（WSC）采用蒽酮比色法测定。色谱分析有机酸条件为：5 mmol/L的硫酸作为流动相，总程序进行时间为15 min，流速为0.5 mL/min，柱温30℃，进样量为5 μL，紫外检测器波长为205 nm。

1.3.4 DNA提取和高通量测序 提取缓冲液（Tris-HCl，pH 8.0）保存的菌体用细菌DNA提取试剂盒（Omega，USA）进行总DNA提取。 用Nanovue超微量紫外分光光度计对所获取的DNA进行质量浓度测定，提取的DNA质量浓度应大于50 ng/μL，提取体积大于60 μL。将提取的12 d和30 d的酸菜中所含的菌体DNA委托北京市理化分析测试中心生物部进行高通量测序。对原始数据进行过滤处理，去除嵌合体序列得到有效序列后，在97%的相似水平下对所有序列进行OTU划分，进而进行聚类分析，每一个聚类称为一个物种操作单元 （Operational Taxonomic Units，OTU），对OTU的代表序列作分类学分析。基于分类学信息，在门和属水平上进行群落结构的统计分析，综合讨论酸菜发酵不同接种处理的细菌群落。

1.3.5 数据分析与处理 应用Origin8.5软件进行图表绘制；采用SPSS 23.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 各乳杆菌菌株培养特性

本研究中液体MRS葡萄糖培养基的初始pH值为6.32，液体MRS木糖培养基的初始pH值为5.71，监测了48 h内每8小时的OD600、pH、可滴定酸的变化规律，结果见图1。生长曲线结果显示，在培养8 h后，L.curvatus生长曲线便趋于平缓；在16 h后，L.oligofermentans、L.plantarum生长曲线趋于平缓；L.brevis生长曲线一直在缓慢上升。在48 h结束时，L.plantarum的OD600值 最 高为2.44，L.brevis最 低 为1.59。在培养的前16小时内，菌株培养液的pH值快速下降。可滴定酸结果显示，乳酸菌产酸能力与pH值有关，即随着pH的下降，可滴定酸质量浓度在逐渐增加，说明产酸能力强的菌株也有较强的耐酸性 。L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus和L.plantarum的可滴定酸质量浓度在48 h时分别达到6.66、13.43、12.84、15.22 g/L。

图1 菌株生长及产酸动态Fig.1 Dynamics of growth and acid production of four strains

2.2 酸菜发酵体系pH动态

发酵体系的pH动态变化见图2。从图2可以看出，接种乳酸菌的酸菜处理组pH下降速度比对照组快。接种乳酸菌的酸菜体系中pH的下降主要发生在前12天，对照组pH的下降主要发生在前18天。L.brevis接种的酸菜体系在第30天pH值是所有处理组中最高的。L.plantarum接种的酸菜体系pH下降最快，在第12天下降到3.5，之后其pH值也一直保持最低值。在发酵30 d结束时，所有酸菜的pH值都在4以下。

图2 酸菜发酵体系pH和有机酸Fig.2 Dynamics of pH and organic acids （lactic acid，acetic acid）during sauerkraut fermentation

2.3 发酵过程中有机酸（乳酸和乙酸）的质量浓度

在以前的研究中发现，东北酸菜发酵体系的有机酸主要为乳酸和乙酸[7-8]。作者对这两种有机酸进行了检测，结果显示所有接种处理的乳酸质量浓度随发酵时间的延长在持续上升，仅对照组在发酵的第24～30天有轻微下降。 在发酵前6天，L.curvatus与L.plantarum接种处理的酸菜发酵体系乳酸质量浓度显著比其他3组高 （p＜0.05）。发酵30 d时，L.curvatus接种处理的酸菜乳酸菌质量浓度最高，达到11.79 g/L，其次为L.plantarum，两组差异不显著。在发酵过程中，所有处理组的乙酸质量浓度也一直在上升，L.brevis、L.oligofermentans接种 处理组与对照组在发酵初期就有乙酸产生，而L.plantarum、L.curvatus接种的酸菜分别在发酵的第6天与第12天后才开始有乙酸产生。最终，L.brevis、L.oligofermentans接种处理的酸菜发酵体系乙酸质量浓度分别达到1.44 g/L和1.48 g/L，显著高于其他3组。

2.4 发酵过程中的可溶性糖质量分数

发酵过程中的可溶性糖质量分数见图3（a）。白菜初始可溶性糖的质量分数是38.83 mg/g，可溶性糖的质量分数在发酵过程中是一直下降的。在发酵的前18天，L.brevis、L.oligofermentans接种处理组可溶性糖质量分数下降的比较快，L.curvatus、L.plantarum接种处理组与对照组可溶性糖质量分数下降比较慢， 在第24天时，L.curvatus、L.plantarum接种处理组可溶性糖质量分数最高。到发酵完成时，所有处理组的可溶性糖质量分数都在5.6 mg/g以下。乳酸菌消耗发酵原料中的可溶性糖使体系中的pH迅速下降，并产生大量的有机酸[10]，可溶性糖的这种下降趋势显示了底物的消耗状态，与体系的pH下降及有机酸尤其是乳酸的积累趋势相符。

2.5 发酵过程中的微生物菌落动态

图3（b）显示了发酵过程中乳酸菌数量变化，在发酵过程的前6天，对照组的乳酸菌数量显著少于接种乳酸菌的酸菜体系 （p＜0.05），L.curvatus与L.plantarum接种的处理组乳酸菌数量最高，分别是8.82 lg（CFU/mL）和8.7 lg（CFU/mL），这与其培养特性相一致。对照组乳酸菌数量到发酵第24天时一直缓慢增长，在第24天到达8.38 lg（CFU/mL）。接种处理组乳酸菌的数量一直在（8～9） lg（CFU/mL）。 图3（c）显示了发酵过程中其他细菌数量变化，在整个发酵过程中，所有处理组的其他细菌的数量在8 lg（CFU/mL）左右。

2.6 发酵过程中各接种处理的细菌群落多样性

2.6.1 OTU分析 对样品进行OTU聚类分析，涵盖了2门、2纲、7目、16科、28属。 不同处理组在12 d和30 d发酵时间点OTU数量见图4。随着发酵的进行，每个处理组OTU的数量都分别降低。即在发酵期间，白菜中的营养物质被不断消耗，pH值在不断降低，因为缺少营养物质和不耐酸，样品中的微生物种类在不断减少。

图3 酸菜发酵体系中的可溶性糖质量分数和微生物数量动态Fig.3 Dynamics of water-soluble carbohydrates and colony forming units during sauerkraut fermentation

图4 发酵第12天和第30天OTU数量Fig.4 OTU at 12 d and 30 d in the fermentation

2.6.2 不同处理的细菌菌群结构分析 高通量测序结果显示，在门的水平上，所有处理组总细菌组成主要由厚壁菌门（Firmicutes）与变形菌门（Proteobacteria）组成，占据菌群总量的99.9%，见图5（a）。在发酵整个过程中，Firmicutes始终占据主要优势，相对丰度为60.2%～71.6%之间。其在所有接种处理中的相对丰度比对照组高，Proteobacteria的相对丰度较低。当发酵达到30 d，L.plantarum的厚壁菌门相对丰度最高。

图5 不同细菌群落在门和属水平上的组成Fig.5 Composition of the different bacterial communities atthe phylum and genuslevelsduring the fermentation

在属的水平上，不同的酸菜样品共分离得到31个属，图5（b）为相对丰度大于0.1%的菌群分布柱状图。在属水平上主要检测到的是乳酸菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）。其它的菌属主要包括Psudomonas、Acinetobacter、Serratia、Proteus、Klebsiella、Erwinia、Enterobacter、Citrobacter和Enterobacteriaceae等。 由图5可知，所有处理中乳酸菌一直占据主要优势。对于微生物整体组成，不同接种处理存在有明显差异。所有接种处理组中Lactobacillus的相对丰度高于对照组。Leuconostoc的比例低于对照组，Enterobacteriaceae的比例高于对照组。12 d发酵时，各处理之间比较可见，L.curvatus接种处理中的Lactobacillus比例较高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例较低；30 d发酵时，L.plantarum处理中Lactobacillus比例较高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例较低。

3 讨论

采用了4种乳酸杆菌作为接种剂，从发酵体系的理化指标和细菌群落的组成及动态变化对接种不同种乳酸杆菌对东北酸菜发酵特性的影响进行了系统的分析。

pH值是评定蔬菜发酵程度的重要指标[11-12]。pH值下降速度快，表明蔬菜进入定向发酵越早，酸菜成熟速度也就越快。本研究中，各接种处理组酸菜的pH值下降、乳酸产生速度均比对照组快，说明4种接种用乳酸杆菌均使发酵进程显著缩短，这与已有关于蔬菜发酵文献报道的结果类似[13]。本研究应用高效液相色谱法分析发酵体系中的乳酸和乙酸的质量浓度，结果显示乳酸是酸菜中主要的有机酸，与已有的研究报道一致[14-15]。 在5组处理中，L.curvatus与L.plantarum接种处理的酸菜发酵体系乳酸质量浓度最高，说明同型发酵乳酸菌可以显著提高发酵体系中的乳酸质量浓度[16]；L.brevis和L.oligofermentans接种处理的酸菜发酵体系乙酸质量浓度最高，且在发酵第6天，只在L.brevis、L.oligofermentans和对照组体系中检测到乙酸，说明乙酸主要来源于异型发酵乳酸菌的作用[17]。乙酸被认为是有效的抗菌化合物，可以抑制发酵食品中病原真菌和腐败菌的生长[18]，适当提高发酵酸菜中的乙酸质量浓度，对于产品风味的提高具有一定的积极作用[19]。

在发酵前6天，接种处理组乳酸菌数量高于对照组，是由于发酵开始时接入了数量较高的乳酸菌。在发酵第12天到发酵结束，各处理组乳酸菌数量区别并不显著，与有关的接种蔬菜发酵文献报道一致[20-21]。这说明接种处理在发酵前期对乳酸菌的数量有着显著影响，之后随着时间的延续影响不再显著。可能的原因是当体系pH足够低，有机酸积累到一定值时，体系内除乳酸菌外的其它菌不再生长，乳酸菌增殖也达到稳定的结果。本研究中L.curvatus、L.plantarum接种处理组酸菜的可溶性糖质量分数下降速度最慢，这与以往的研究结果不一致[8]，分析可能的原因是本研究中原料中的可溶性糖质量分数相对较高，乳酸菌发酵利用可溶性糖产生足够的乳酸后使体系内的微生物消耗糖的速度减慢所导致。

作者用高通量测序技术分析了在第12天和第30天各处理组的细菌组成和动态变化。在门水平上，Firmicutes和Proteobacteria是酸菜样品中的优势细菌门，这与以往的研究结果一致[22-23]。酸菜发酵可分为两个阶段，即由Leuconostoc占优势的异型发酵阶段和以L.plantarum为主的同型发酵阶段[24-25]。在本研究中，接种处理组Leuconostoc相对丰度低于对照组，Lactobacillus的相对丰度高于对照组。在本研究中，接种处理的酸菜体系Enterobacteriaceae和Psudomonas相对丰度低于对照组。已有的研究结果显示，Enterobacteriaceae和Psudomonas会利用酸菜中游离的氨基酸生成破坏酸菜质量的生物胺（主要是腐胺和尸胺）[26]，同时与乳酸菌竞争使用糖类，减少乳酸的生成。乳酸菌会降低发酵体系的pH，生成有机酸、过氧化氢、细菌素等物质抑制Enterobacteriaceae、Psudomonas和Listeria monocytogenes等食源性病原菌和腐败菌的生长[27-29]，这说明接种处理提高了酸菜的品质。接种处理使体系发酵前期的乳酸菌数量升高，乳酸菌可以利用少量的碳水化合物来合成大量的有机酸，进而造成体系pH的降低，抑制Enterobacteriaceae和Psudomonas的生长，这也与发酵蔬菜的研究结果一致[30-32]。

4 结 语

使用这4株乳酸菌接种酸菜缩短了酸菜的发酵时间，改善了酸菜的品质。结合生理生化指标及微生物组成分析结果，若欲使酸菜发酵体系的pH下降及乳酸积累更快，使用L.curvatus与L.plantarum更好，从终产品的微生物安全性来看，L.plantarum更值得推荐。本研究结果将为筛选符合不同发酵目的的接种剂提供技术参考。