温度、保湿时间及菌龄对扩展青霉H1侵染柑橘能力的影响

赵利娜， 李慧芳， 张晓云， 张红印

（江苏大学 食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

柑橘在采后运输贮藏期间的腐烂大多是由真菌侵染造成的[1-2]，黑腐病（Black rot）、褐腐病（Brown rot）、炭疽病（Anthracnose）[3]等通常是采前已经开始侵染柑橘，采后才发病。酸腐病（Sour rot）[1]、青霉病（Green mold）、绿霉病（Blue mold）[4-5]等则是在采摘过程中及采后发生侵染。柑橘采后由扩展青霉（Penicillium expansum）[6]、意大利青霉（Penicillium italicum）、指状青霉（Penicillium digitatum）等青霉属引起的青霉病和绿霉病造成的腐烂最为严重[7]。柑橘的青霉病和绿霉病在柑橘果实上发病症状较为相似，侵入柑橘后伤口附近变软，接着长出白色菌丝体，最后中间部位变为青色或绿色，腐烂范围逐渐扩大，直至全果腐烂[8]。

病原菌成功侵染宿主不是一个简单的过程。自然界中寄生能力较强的真菌可直接侵染宿主，或通过自然孔口进行侵染，如茄链格抱菌（Alternariasolani）可通过直接侵入的方式引起马铃薯的早疫病[9]。引起柑橘腐烂的P.digitatum、P.italicum等分布范围较广，但它们寄生能力较弱，多数情况下会潜伏在水果表面，不会对水果品质造成影响，只有宿主表面出现伤口组织时才可以完成侵入[10]。因此，在柑橘采后运输贮藏过程中要尽量避免果实出现伤口，以减少病原菌侵染的概率。当病原菌成功侵入到宿主体内后，必须有适宜的温度、湿度才能生长繁殖。P.italicum的发病温度为23℃，P.digitatum发病温度较P.italicum高，在储藏初期柑橘的腐烂大都由P.italicum引起[11]。储藏后期温度逐渐升高，各种病原菌进入繁殖的活跃期，协同发挥作用。除此之外，病原菌的菌龄也会影响其侵染宿主的能力，菌株生长达到成熟期侵入到宿主体内造成的危害远大于其它时期。

P.expansum的寄生能力较弱，通过宿主的伤口组织侵入后，自身的菌龄以及外界环境条件如温度和湿度等都会影响后续的侵染速度和发病程度。Mersha等人研究发现假尾孢叶斑病（Pseudocercospora fuligena）侵染番茄时菌龄为7 d的发病率比21 d的高出50%，在28℃的潮湿环境中潜育期最短[12]。王翠翠等发现套袋苹果黑点病病原菌 （Alternariatenuissima）在29.4℃时侵染速度最快[13]。陆宁海等人的研究结果表明，温度和湿度持续时间对P.italicum侵染柑橘具有较大的影响[14]。目前对于柑橘采后病原菌侵染的研究主要以指状青霉（P.digitatum）[15]和意大利青霉（P.italicum）为主，而对P.expansum侵染柑橘条件的研究还未见相关文献报道。作者所在实验室前期从腐烂柑橘伤口处筛选得到一株致病菌H1，经鉴定，确定为扩展青霉，命名为P.expansumH1[16]。目前还没有菌龄、温度和湿度等条件影响P.expansum侵染柑橘的报道，因此，作者对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响因素进行了研究，以期为防治P.expansum的侵染提供必要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

电子显微镜：购于江南光学仪器厂；LRH-250生化培养箱：购于上海恒一科技有限公司；GR85DR型全自动高压灭菌锅：购于致微（厦门）仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：购于苏州净化设备有限公司；血球计数板：购于丹阳市健陵医疗器械公司。试验所用试剂：均购于镇江华东化玻有限公司。

1.2 菌悬液的制备

试验所用菌种P.expansumH1系从江苏省镇江市江心洲生态果园收集的腐烂柑橘伤口处分离纯化得到。将P.expansumH1接种于PDA培养基（马铃薯200 g，加水煮沸20 min，过滤后往滤液中加入20 g葡萄糖，20 g琼脂，蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌20 min）上活化，25℃培养7 d，用接种环挑取孢子至无菌生理盐水中，振荡混匀，用无菌枪头吸取菌悬液从盖玻片侧边滴于血球计数板上，吸掉盖玻片外多余液体，在10×40倍显微镜下计算菌悬液的孢子浓度，调整孢子浓度至1×106个/mL备用。

1.3 柑橘果实

柑橘（广西蜜桔）选用果园中成熟度一致，外观色泽大小均一且表面无机械损伤的果实，先用清水将柑橘表面尘土等冲掉，再浸入到0.3%的NaClO中杀菌消毒2 min，最后用清水冲洗干净，室温下自然晾干。在柑橘赤道位置用灭菌打孔器打3个相同均匀分布的伤口（5 mm×3 mm）备用。

1.4 温度对P.expansum H1侵染柑橘能力的影响

在柑橘伤口处加入30 μL浓度为1×106个/mL的P.expansumH1的菌悬液，2 h后用保鲜膜密封装有柑橘的筐子，分别置于 4、10、15、20、25、30、35 ℃，95%RH恒温恒湿培养箱中。每个筐中放12个柑橘，每个处理3个平行，整个试验重复3次，逐日观察统计潜育期和柑橘腐烂情况。

1.5 保湿时间对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响

在柑橘伤口处加入30 μL浓度为1×106个/mL的P.expansumH1的菌悬液，2 h后将浸有5 mL无菌水的加湿棉球放入装有柑橘的筐子中。密封后置于25℃恒温培养箱中。保湿时间设置为8、16、24、32、40、48 h，完毕后移去加湿棉球。每个筐中放12个柑橘，每个处理3个平行，整个试验重复3次。逐日统计腐烂情况和潜育期，每隔24小时记录柑橘腐烂情况。

1.6 菌龄对P.expansum H1侵染柑橘能力的影响

在柑橘伤口处加入 30 μL 不同菌龄（3、7、11、15、19 d）浓度为 1×106个/mL 的P.expansumH1 的菌悬液，密封后放置于25℃、95%RH恒温恒湿培养箱中。每个筐中放12个柑橘，每个处理3个平行，整个试验重复3次，分别在第4、7、10天观察统计柑橘腐烂情况。

1.7 数据统计与分析

实验进行3次生物学重复，以实验数据平均值±均值标准误差（mean±SEM）表示。数据统计学分析采用SPSS 16.0软件的Student's t检验或One-Way ANOVA的Tukey’s检验。P值小于0.05被认定为数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 温度对P.expansum H1侵染柑橘能力的影响

温度对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响见表 1和图 1-2。由表 1可知，温度对于P.expansumH1侵染的速度有较大影响。柑橘在25℃时35～40 h已经开始发病；其次是20℃，潜育期为43～48 h；15℃时潜育期是67～72 h；10℃和35℃潜育期最长，为72～77 h（除4℃外）。图1-2的结果显示，25℃时柑橘的腐烂率和腐烂直径在48、72、96 h始终高于其他温度，处于4℃的柑橘在试验期间并未腐烂。48 h时20、25、30℃柑橘已经开始腐烂，其它温度的柑橘并未腐烂。72 h时所有温度的柑橘都已腐烂，25℃的柑橘腐烂率达到90.3%，是35℃的10.8倍，腐烂直径为12.7 mm （伤口直径是3 mm），其次是20℃和30℃，腐烂率为 80.6%和72.2%，腐烂直径为10.9 mm和9.7 mm。96 h时25℃的柑橘腐烂率高达98%，几乎已经全部腐烂，腐烂直径为19.9 mm。以上结果表明，P.expansumH1在25℃时潜育期最短，侵染柑橘的能力最强，4℃时P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。

表1 温度对柑橘发病潜育期的影响Table 1 Effects of temperature on infection incubation period of citrus

图1 温度对P.expansum H1侵染柑橘腐烂直径的影响Fig.1 Effects of temperature on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

图2 温度对P.expansum H1侵染柑橘腐烂率的影响Fig.2 Effects of temperature on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.2 保湿时间对P.expansum H1侵染柑橘能力的影响

不同保湿时间对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响见图3-4。可以看出，湿度对于P.expansumH1的侵染能力也有很大影响。在第48小时，保湿时间为8 h的柑橘腐烂率为12.5%；保湿时间为48 h的腐烂率高达86%，腐烂直径为11.2 mm，是保湿8 h的2倍左右；96 h后保湿8 h的柑橘腐烂率为93%，腐烂直径是12.4 mm；保湿时间32 h以上的柑橘腐烂率全部达到100%，腐烂直径在16 mm以上，最高达21.3 mm。从时间节点分析，保湿48 h的柑橘腐烂直径扩展的速度较快。以上结果表明，保湿时间越长，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐烂率越高，腐烂直径越大。

图3 保湿时间对P.expansum H1侵染柑橘腐烂直径的影响Fig.3 Effects of wetness duration on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

图4 保湿时间对P.expansum H1侵染柑橘腐烂率的影响Fig.4 Effects of wetness duration on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.3 菌龄对P.expansum H1侵染柑橘能力的影响

菌龄对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响见图5-6。不同菌龄的P.expansumH1侵染柑橘的能力有较大区别。培养7 d的P.expansumH1对柑橘的侵染能力最强，在第4、7、10天的腐烂率和腐烂直径始终高于其它处理组。第4天时接种培养7 d的P.expansumH1的柑橘腐烂直径为11.3 mm，腐烂率已经达到80%，是培养3 d菌株的5倍；第10天时柑橘腐烂率的大小依次为培养7 d（99.3%）＞培养11 d（88.6%）＞培养 15 d（71.6%）＞培养 19 d（63.7%）＞培养3d（59.3%），且培养7 d的腐烂直径也最高，为30.2 mm。以上结果表明，培养7 d的P.expansumH1侵染能力最强，培养11 d的次之，培养3 d的最弱。值得注意的是，P.expansumH1在培养19 d后虽致病力下降，但依然可以引起柑橘腐烂，具有较强的侵染能力。

图5 菌龄对P.expansum H1侵染柑橘腐烂直径的影响Fig.5 Effects of fungus age on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

图6 菌龄对P.expansum H1侵染柑橘腐烂率的影响Fig.6 Effects of fungus age on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

3 结 语

P.expansum可引起柑橘采后绿霉病的发生，是除P.italicum和P.digitatum外造成柑橘腐烂的另一主要致病菌。作者研究了不同温度、保湿时间以及菌龄对P.expansumH1侵染柑橘能力的影响。实验结果表明，温度、保湿时间和菌龄对P.expansumH1侵染柑橘的能力都有很大影响。通过腐烂率、腐烂直径及潜育期的测定结果发现，P.expansumH1在25℃时潜育期最短，侵染柑橘的能力最强，4℃时P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。同时，保湿时间越长，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐烂率越高，腐烂直径越大。此外，培养7 d的P.expansumH1侵染柑橘的能力最强。陆宁海等的研究发现，P.italicum的菌龄和外界环境条件如温度、保湿时间都会影响柑橘青霉病（P.italicum）的发病[14]，本研究结果与其基本一致。菌龄为7 d的P.expansumH1在25℃、保湿时间48 h时最适宜侵染柑橘发病，说明该菌侵染需要较高的温度和较长的保湿时间。培养3 d的菌株致病性较弱，可能是由于培养时间较短，P.expansumH1致病能力不足。柑橘在长时间的运输和贮藏过程中温度和湿度都会升高，为P.expansum的侵染提供了有利的条件，这可能是近年来P.expansum引起的柑橘采后病害日益严重的原因。因此在柑橘采后运输贮藏过程中应及时通风降温除湿，以有效控制P.expansum的生长繁殖。