自然发酵型水豆豉细菌菌群的动态监测研究

黄晓润，郭娅，黎忠杰，曾金兴，吴拥军

(贵州大学 生命科学学院，贵阳 550025)

水豆豉是以大豆为原料，经浸泡、蒸煮、制曲、发酵等工艺加工而成[1]，具有极高营养价值和医疗价值的豆制品[2]。水豆豉是利用细菌等多种微生物发酵而成的食品[3]，其微生物主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸菌(Lactobacillus)和微球菌(Micrococcus)[4-6]。因豉香诱人，同时具有极高的营养价值[7]，以及抗氧化、降血糖、降血压、预防骨质疏松、溶栓、防癌等生理功效[8-12]，因此，水豆豉逐渐受到消费者的喜爱，并引起了科研人员的兴趣[13]。

但是由于水豆豉的生产方式至今仍较落后，生产周期较长，导致其生产品质不稳定，随着食用人群的增多，随之出现的豆豉安全性问题也逐渐增多，备受消费者与研究人员的关注[14]，目前关于自然发酵型水豆豉的细菌菌群动态变化的研究鲜有报道。

研究应用DGGE-PCR技术对贵州某工厂生产的自然发酵型水豆豉进行细菌菌群的动态监测研究，这对掌握自然发酵型水豆豉生产过程中食源性致病菌的动态变化，评估其生物安全性以及指导生产控制具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸钠(CH3COONa·3H2O)、95%乙醇、盐酸：重庆川东化工有限公司；柠檬酸氢二铵([(NH4)2HC6H5O7])：湖北兴银河化工有限公司；结晶紫：湖北大学化工厂；Na2EDTA·2H2O(ethylene diamine tetraacetic acid)、丙烯酰胺(acrylamide)、去离子甲酰胺(formamide deionized)、TEMED(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine)：AMRESCO公司。

自然发酵豆豉样本：采集自贵阳某工厂曲房，制曲期间每隔6 h采集一次，采集3 d。后发酵每隔1 d采样一次，采集7 d。

E.coliBL21(DE3)为本实验室保藏菌种；测序载体pGEM-T Easy Vector System I购自Promega公司。

1.2 仪器与设备

标准型净化工作台 上海锦星科学仪器有限公司；VORTEX-GENIE2漩涡混合器 基因有限公司；XSZ-G生物显微镜 泰克仪器有限公司；GMSX-280高压灭菌锅 英国阿斯太欧(Astell)公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Universal Hood Ⅱ凝胶成像分析仪 Bio-Rad公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR仪 AB公司。

1.3 方法

1.3.1 自然发酵接种

刚蒸煮的黄豆，带上手套不停翻凉至40 ℃后，做好标记，放置于曲房。

1.3.2 宏基因组的提取

豆豉样本宏基因组DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取基因组。样品预处理过程：取5 g豆豉于45 mL无菌PBS(pH 7.2)缓冲液中，120 r/min，30 min；吸取1 mL菌悬液，500 r/min，离心10 min。室温静置30 min，管底有沉淀；移上清液至新EP管中，12000 r/min，离心5 min，弃上清得沉淀；分别吸取500 μL灭菌生理盐水，重悬菌体之后再补500 μL无菌PBS缓冲液，颠倒混匀，12000 r/min，5 min，重复2次。沉淀再用无菌TE缓冲液(pH 8.0)重悬菌体2次，将沉淀移置于另一EP管中。

1.3.3 引物设计及PCR扩增

选取几对细菌通用引物登录NCBI进行比对，所用引物见表1。

表1 细菌PCR引物Table 1 The bacterial PCR primers

注：GC clamp*序列-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

采用降落式PCR(Touchdown PCR)，其反应体系为：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Primer F with GC 1 μL、Primer R 1 μL、Template 1 μL、Taq 0.25 μL、UPW 37.25 μL。反应程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；68 ℃(每降0.5 ℃ 1个循环) 30 s；72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，20个循环；58 ℃ 30 s；20个循环，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，1个循环；4 ℃，∞。

1.3.4 DGGE凝胶电泳及图谱分析

参照Muyzer等[15]的方法，对细菌16S rDNA 的扩增产物进行DGGE分析。电泳结束后用 Quantity One(Bio-Rad)进行条带数、多样性及粗定量分析。

1.3.5 DGGE切胶回收及克隆测序

切取目的片段，加ddH2O，于4 ℃ 过夜保存。取1 μL上清液作为模板，进行PCR扩增，采用Omego试剂盒回收纯化，与载体连接后，转化至感受态细胞过夜培养。经质粒PCR鉴定，取阳性质粒送至宝生物工程(大连)有限公司。

2 结果与分析

2.1 宏基因组的提取

图1 制曲期间自然发酵豆豉基因组图Fig.1 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL15000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉发酵时间分别为 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

图2 后发酵期间自然发酵基因组图Fig.2 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL15000 DNA marker; 泳道1～7表示水豆豉发酵时间分别为1，2，3，4，5，6，7 d。

由图1和图2可知，自然发酵制曲和后发酵期间，条带都较为完整，片段大小至少大于15000 bp，可进行下一步PCR扩增。基因组提取，片段明亮且较为完整，片段大小至少大于15000 bp，适应于进行后续实验和PCR扩增。

2.2 PCR扩增细菌16S rDNA基因组27F-1492R

图3 制曲期间自然发酵水豆豉27F-1492R扩增Fig.3 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker; 泳道1～12表示水豆豉发酵时间分别为 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

图4 后发酵期间自然发酵水豆豉27F-1492R扩增Fig.4 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～7表示水豆豉发酵时间分别为1,2,3,4,5,6,7 d。

由图3和图4可知，自然发酵型水豆豉用16S rDNA基因组引物27F-1492R扩增出目的条带，大小为1465 bp，条带单一，满足后续细菌V3区扩增试验对样品DNA质量要求。

2.3 PCR扩增细菌V3区

图5 制曲期间自然发酵豆豉细菌V3区PCR扩增Fig.5 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉发酵时间分别为 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

图6 后发酵期间自然发酵豆豉细菌V3区PCR扩增Fig.6 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker；泳道1～7表示水豆豉发酵时间分别为1,2,3,4,5,6,7 d。

由图5和图6可知，以总DNA产物为模板，采用降落式PCR程序进行细菌16S rDNA V3可变区的扩增，所有样品均扩增出碱基长度约为250 bp，目标条带单一，满足后续DGGE试验对样品DNA质量要求。

2.4 自然发酵型水豆豉不同阶段DGGE结果

自然发酵型水豆豉不同阶段DGGE结果见图7。

图7 自然发酵水豆豉DGGE结果Fig.7 The DGGE result of naturally fermented soya beans

注：条带CK表示未发酵样品；条带1～11表示水豆豉发酵时间分别为6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h;条带12～18表示水豆豉后发酵时间分别为1，2，3，4，5，6，7 d。

制曲期间发酵6～48 h、后发酵54 h～7 d鉴定结果见表2。

表2 制曲期间发酵6～48 h、后发酵54 h～7 d鉴定结果Table 2 The identification results of fermenting for 6～48 h during koji making and 54 h～7 d during post fermentation

续 表

不同发酵时间条带数统计见图8。

图8 不同发酵时间条带数统计Fig.8 The bands statistics of different fermentation time

PCR-DGGE技术分离出16种微生物(见图9)，其中豆子样本(CK)中，Serratiamarcescens、枯草芽孢杆菌属(Bacillussp.)、Alcaligenesfaecalis是豆豉未发酵，刚放进曲房存在的微生物。嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)以及热噬淀粉芽孢杆菌的存在是因为豆豉发酵环境中，曲温达到 50 ℃左右，适宜嗜热细菌的生长，而其他一些不适宜高温的微生物则被抑制。其中，人参土芽孢杆菌(Bacillusginsengihumi)仅出现在发酵42～48 h。

自然发酵制曲后期及后发酵时期，特有的微生物有索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis)、地衣芽孢杆菌。丛毛单胞菌属(Comamonasjiangduensis)只存在后发酵5～6 d。

图9 自然发酵水豆豉CK～48 h、54 h～7 d细菌分布Fig.9 The bacterial distribution of naturally fermented soya beans at CK～48 h, 54 h～7d

3 讨论

通过PCR-DGGE鉴定，枯草芽孢杆菌自然发酵豆豉在制曲阶段的18条条带中，有12条属于枯草芽孢杆菌属，后发酵阶段的19条条带中，有11条属于枯草芽孢杆菌属，证实了枯草芽孢杆菌的数量及种类具有绝对优势，为主酵微生物。枯草芽孢杆菌属中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)以及热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans)贯穿整个发酵过程中，且从条带亮度判断，大量存在。

在贵州自然发酵型水豆豉过程中，发现了(条件)致病菌，如奇异变形杆菌，这在国内外豆豉微生物分离鉴定的报道中，第一次在贵州自然发酵型水豆豉中分离得到，其中还包括蜡样芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，存在于豆豉后发酵1～7 d期间。蜡样芽孢杆菌是常见的食品污染菌和条件致病菌，污染的食物主要为含淀粉较多的各类食物[16]，同时还检测到粪肠球菌(Enterococcusfaecium)，其具有较强的产酪胺和苯乙胺能力[17]，变形杆菌属可产组胺，球肠菌属可产酪胺，沙雷氏菌属可产腐胺。推测豆豉发酵过程中，芽孢杆菌属、奇异变形杆菌、居泉沙雷菌以及屎肠球菌与贵州水豆豉生物胺产生息息相关。

粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)可以抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)等微生物，通常对人体无害，可致病，引起肠炎、尿路感染，大多不严重。研究分离出来的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)是目前可利用于生物防治领域的菌株，在贵州自然发酵型水豆豉中上述菌株为主要发酵菌株。

以上说明自然发酵型水豆豉目前存在潜在的食品安全问题，分析可以通过添加辅料、控制发酵条件或控制生产环境来抑制甚至杀死原料中本身带有的致病菌或条件致病菌，本研究对贵州自然发酵型水豆豉的分析以及对其致病菌的防控具有重要意义。同时，枯草芽孢杆菌属与其他菌属是否具有拮抗作用的研究，从细菌菌群演变情况监测水豆豉生物胺的含量，不同地区豆豉样本的差异还可进一步研究。

4 结论

研究通过PCR-DGGE技术在贵州传统自然发酵型水豆豉中鉴定，枯草芽孢杆菌的数量及种类具有绝对优势，为主酵微生物。共有的种群包含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)以及热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans)。研究表明，贵州水豆豉中微生物多样性较高，研究结果为探索特色水豆豉的安全标准化生产加工及其生物安全性提供了参考。