响应面法优化水豆豉纯种发酵产大豆异黄酮的条件

沈丹芸，董科，范紫玮，陈静娴，何迅，裴晓方*

(1.四川大学 华西公共卫生学院(华西第四医院)，成都 610041；2.食品安全监测与风险评估四川省重点实验室，成都 610041)

豆豉是黑豆或黄豆经微生物发酵而制成的一种历史悠久的中国传统调味食品，因具有独特的风味而广受大众的喜爱[1]。豆豉一般分为毛霉型、曲霉型、根霉型和细菌型[2]。水豆豉为细菌型豆豉，用其制作的菜品“色、香、味”俱全，在四川、云南和贵州等地区得以普遍食用。

水豆豉生产过程中会产生大豆异黄酮、多肽、纤溶酶、维生素等多种有利于人体健康的生物活性物质[3-6]。大豆异黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等功能，其含量和活性与水豆豉发酵过程中的发酵菌株以及发酵条件密切相关，目前，传统发酵水豆豉在微生物及流程控制方面较不规范，发酵过程繁琐且易受杂菌污染[7]，故寻求一种高效安全的发酵方式有利于水豆豉的科学化生产。

本研究利用前期实验中筛选出的一株水豆豉高效发酵菌株纯种发酵黄豆，以大豆异黄酮含量和感官评价得分为响应值，通过单因素实验、响应面法探究水豆豉发酵的最佳条件，为研发高产大豆异黄酮的水豆豉提供了思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷、染料木素、大豆黄素、黄豆黄素：均购自成都德思特生物科技有限公司，均为国产分析纯；乙腈、甲醇、冰乙酸：均购自成都市科隆化学品有限公司，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000液相色谱仪 美国DIONEX公司；GI547W高压灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司；RE-5299旋转蒸发仪 巩义市英峪高科仪器厂；MIR-554-PC低温恒温培养箱 日本Panasonic公司；SQP电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水豆豉的发酵过程

称取试样黄豆30 g，加入90 mL蒸馏水，浸泡12 h后，沥干水分，放入高压灭菌锅内121 ℃蒸煮30 min，冷却至室温，接入一定量菌液，在一定的发酵温度下培养一定时间，获得纯种菌株发酵的水豆豉。

1.3.2 大豆异黄酮的测定

按照国家标准GB/T 26625-2011《粮油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法》进行检测[8]。

1.3.3 感官评价指标

评价标准以文献[9,10]为参考，将水豆豉的形态、黏液、拉丝、气味和口感作为评价指标(见表1)，由来自食品相关专业的实验人员组成3人评价小组，各成员分别判别评分后得出的平均分为水豆豉的感官评价结果。

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表1 水豆豉感官评价指标Table 1 The sensory evaluation indexes of fermented soybeans

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续 表

注：拉丝长度测定：将水豆豉搅拌2 min后，用枪头挑起，以10 cm为一个单位，从中间挑起，垂直拉10 cm为两个单位，再从拉起的10 cm中挑起，重复进行，直至拉丝断裂，记录拉丝单位。

1.3.4 单因素实验

分别选取发酵温度、发酵时间、接菌量对水豆豉发酵进行条件优化。

1.3.4.1 发酵温度对水豆豉发酵的影响

在发酵时间为4 d，接菌量为3%，发酵温度分别为20，25，30，35，40，45 ℃的情况下发酵，考察水豆豉样品的大豆异黄酮含量和感官评价得分的变化。

1.3.4.2 发酵时间对水豆豉发酵的影响

在接菌量为3%，发酵温度为35 ℃，发酵时间分别为1，2，3，4，5，6 d的情况下发酵，考察水豆豉样品的大豆异黄酮含量和感官评价得分的变化。

1.3.4.3 接菌量对水豆豉发酵的影响

在发酵温度为35 ℃，发酵时间为4 d，接菌量分别为0.5%、1%、3%、5%、7%、9%的情况下发酵，考察水豆豉样品的大豆异黄酮含量和感官评价得分的变化。

1.3.5 响应面法优化水豆豉发酵条件

根据单因素实验结果，利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken模型，选取水豆豉中大豆异黄酮的含量(Y1)、感官评价得分(Y2)为响应值，得出共17个实验点，每个实验重复3次。得出实验结果后，利用软件进行结果分析并得出水豆豉发酵的最优条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 发酵温度对水豆豉发酵的影响

发酵温度是水豆豉发酵的关键影响因素。由图1可知，水豆豉中检测到的大豆异黄酮含量在发酵温度为40 ℃时最高，20～40 ℃时，随着温度的升高而增高，40 ℃之后随着温度升高呈下降趋势，感官评价得分变化与大豆异黄酮含量变化一致。这可能是由于温度在一定范围内增高，有利于细菌的生长和代谢，但温度过高，反而会阻碍细菌的增殖。考虑到枯草芽孢杆菌的最适生长温度一般为30～40 ℃[11-13]，故将水豆豉发酵温度范围缩小为30～40 ℃进行下一步实验。

图1 发酵温度对水豆豉发酵的影响Fig.1 The effect of fermentation temperature on the fermentation of fermented soybeans

2.1.2 发酵时间对水豆豉发酵的影响

图2 发酵时间对水豆豉发酵的影响Fig.2 The effect of fermentation time on the fermentationof fermented soybeans

由图2可知，水豆豉中检测到的大豆异黄酮含量在6 d时达到最大，1～6 d随着发酵时间的增加而升高。而感官评价得分在4 d时最高，4 d之后开始下降。结合两种因素的变化以及从经济和效率方面考虑，缩小发酵时间范围为3～5 d进行下一步实验。

2.1.3 接菌量对水豆豉发酵的影响

图3 接菌量对水豆豉发酵的影响Fig.3 The effect of inoculation amount on the fermentation of fermented soybeans

由图3可知，水豆豉中检测到的大豆异黄酮含量在接菌量为5%时最高，小于5%时，大豆异黄酮含量随接菌量增多而升高，在5%之后再增大接菌量，大豆异黄酮含量的变化趋于平稳。感官评价得分同样在接菌量为5%时达到最大。以上的变化可能与接菌量过大时细菌间相互竞争营养物质和生存空间进而阻碍细菌的生长繁殖接菌量以及过小时黄豆发酵不充分有关。根据以上实验结果，缩小接菌量范围为1%～5%进行下一步实验。

2.2 响应面法确定最优发酵方案

2.2.1 响应面实验设计和结果

在单因素实验结果的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken模型，以发酵温度(A)、发酵时间(B)、接菌量(C)为考察因素，以感官评价得分(Y1)和大豆异黄酮含量(Y2)为响应值进行三因素三水平的中心组合设计。Box-Behnken模型设计因素和水平见表2，实验设计见表3。

表2 Box-Behnken模型设计因素和水平表Table 2 The factors and levels of Box-Behnken model design

表3 响应面实验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

运用软件对实验结果进行分析，构建出以下两组回归拟合模型：

Y1=72.40+1.00A+0.31B-2.19C-0.88AB-1.38AC-1.25BC+1.67A2-1.95B2+0.05C2。

Y2=839.30+46.40A+31.26B-78.70C-91.01AB+43.43AC-9.84BC+40.60A2-116.64B2-68.67C2。

2.2.2 响应面试验方差分析

分别对两组回归拟合模型进行方差分析，结果见表4和表5。两模型的P值分别为P=0.0079<0.01，P=0.0004<0.01，说明该模型有意义且可以与实际结果相拟合。两模型的失拟项P值分别为P=0.5072>0.1，P=0.5570>0.1。模型无失拟因素存在，说明模型与实际结果拟合较好。以上结果说明可以运用此方程进行实际结果的预测。

表4 Y1回归模型方差分析结果Table 4 Variance analysis of regression equation Y1

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

表5 Y2回归模型方差分析结果Table 5 Variance analysis of regression equation Y2

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

由表4可知，A，C因素对感官评价得分的影响有统计学意义，且C因素的影响更为显著，曲面效应A2和B2对感官评价得分的影响也有相关性。由表5可知，B、AC、A2项对大豆异黄酮含量响应值关系较小，而A、C、AB、B2、C2项对大豆异黄酮含量的影响具有显著效应，由F值大小可以判断，以大豆异黄酮的含量为响应值，A，B，C各因素对水豆豉发酵的影响大小的排列顺序为：C>A>B，即接菌量>发酵温度>发酵时间。

2.2.3 响应面交互作用的分析与优化

为了进一步研究影响水豆豉发酵因素的交互作用以确定最优水豆豉发酵条件，对影响水豆豉发酵因素的交互作用进行分析。考虑到感官评价得分具有较高的主观性，于是，在此考察对大豆异黄酮含量这一响应值产生影响的交互作用，经软件分析得出以下结果。

当接菌量为3%时，发酵温度与发酵时间的交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线见图4。

图4 发酵温度与发酵时间交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线Fig.4 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and fermentation time on soybean isoflavone content

由图4可知，当发酵温度为30 ℃时，大豆异黄酮含量随发酵时间增加而升高；在发酵温度为40 ℃时，大豆异黄酮含量随发酵时间的增加而降低；但在发酵温度为30 ℃时变化较为明显。在发酵时间为3 d时，大豆异黄酮含量随发酵温度增高而增高；在发酵时间为5 d时，大豆异黄酮含量随发酵温度增高而降低；但在发酵时间为3 d时，变化较为明显。

当发酵时间为3 d时，发酵温度与接菌量的交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线见图5。

由图5可知，当接菌量一定时，大豆异黄酮的含量随发酵温度升高而增高，尤其是在接菌量为5%时，变化较为明显。当发酵温度一定时，大豆异黄酮的含量大体上随着接菌量的增加而增高，尤其是在发酵温度为30 ℃时，变化较为明显。

图5 发酵温度与接菌量交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and inoculation amount on soybean isoflavone content

当发酵温度为35 ℃时，发酵时间与接菌量的交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线见图6。

图6 发酵时间与接菌量交互作用对大豆异黄酮含量的响应面曲线Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation time and inoculation amounton soybean isoflavone content

由图6可知，当接菌量一定时，大豆异黄酮的含量随发酵时间增加先增高后降低，在4 d左右达到最大值。当发酵时间一定时，大豆异黄酮的含量随着接菌量的增加反而降低。

通过Design Expert 8.0.6软件进一步计算得到以大豆异黄酮含量和感官评价得分为响应值的水豆豉最优发酵条件：发酵温度为40 ℃，发酵时间为3.91 d(69.84 h)，接菌量为1.05%。为了实际操作和生产过程的便利性，将此条件调整为发酵温度40 ℃、发酵时间4 d、接菌量1.00%。

2.2.4 验证实验

根据调整后的结果得到的理论最优条件进行验证实验，重复3次后取平均值，实验结果见表6。

表6 验证实验结果Table 6 Results of validation experiments

由表6可知，依照最优条件进行重复验证实验后得到的实验平均值分别为感官评价得分74.50分，大豆异黄酮含量881.28 mg/kg，与模型计算值78.52分，898.51 mg/kg较为接近，说明利用响应面法对水豆豉最优发酵条件的结果预测较为准确。

3 讨论

水豆豉作为西南地区群众喜食的食品，对于其有益成分的研究和开发具有一定的价值，但目前对中药淡豆豉、霉菌型豆豉发酵产大豆异黄酮条件优化的报道较多[14-18]，对水豆豉发酵产大豆异黄酮条件优化的报道极少，因此，本研究对水豆豉纯种发酵产大豆异黄酮条件优化的资料进行了补充。本研究结果中，水豆豉在最优条件下产大豆异黄酮含量为881.28 mg/kg，与未发酵黄豆的大豆异黄酮含量(645.78 mg/kg)相比高出36.47%，说明最优条件下发酵水豆豉的确使得水豆豉中生物活性成分——大豆异黄酮含量大幅增加，与刘亚琼等[19]报道的四川地区豆豉中大豆异黄酮含量的平均值428 mg/kg相比，高出1倍左右，说明本研究结果具有实际意义。

本研究采用响应面法对水豆豉的发酵条件进行了优化，此法在实验的基础上，结合统计学方法以及数学模型，巧妙地运用了具有代表性的实验点通过计算得到最优响应值，相比于传统的正交实验，具有实验次数少、精密度及准确度较高等优点[20]，故本研究结果较为可靠，可以为水豆豉的发酵工艺提供思路。

4 结论

本研究通过单因素实验、响应面法Box-Behnken模型，以大豆异黄酮和感官评价得分为响应值纯种发酵黄豆，得到以发酵温度为40 ℃、发酵时间为4 d、接菌量为1.00%的最优发酵条件，在此条件下发酵得到水豆豉感官评价得分为74.50分、大豆异黄酮含量为881.28 mg/kg的最高结果值，此结果中大豆异黄酮含量和未发酵黄豆的大豆异黄酮含量相比有明显升高。

不同于传统发酵水豆豉发酵周期长且质量难以控制，本研究为纯种发酵水豆豉，通过研究结果得出最优发酵条件，为水豆豉的科学生产以及相关食品、保健品的开发提供了理论参考。