TMPRSS2-ERG融合基因与转移性去势抵抗性前列腺癌化学药物治疗后生存率的关系

谢英伟 金仕鹏 李 爽 王永辉 王 伟 平 浩 刘跃新

(首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌是目前全球男性最常见的恶性肿瘤之一。随着疾病的进展，多数前列腺癌将转变为转移性去势抵抗性前列腺癌 (metastatic castration resistant prostate cancer，mCRPC)[1]，目前，多西他赛为转移性去势抵抗性前列腺癌患者的一线治疗药物[2]。然而约50%的患者对化学药物治疗(以下简称化疗)先天耐受，起初对化疗敏感的患者最终也会发展为化疗耐受。临床观察[3]和实验研究[4]表明化疗耐药与肿瘤转移密切相关。如化疗耐药的肿瘤易发生远处转移，转移的肿瘤具有更强的化疗耐药性。本课题组[5]研究发现TMPRSS2-ERG(T-E)融合基因更易出现在淋巴结转移的前列腺癌中。本研究对前列腺癌化疗患者进行融合基因的测定，以评估融合基因与化疗耐药之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选取首都医科大学附属北京同仁医院前列腺增生患者20例，前列腺癌化疗患者50例为研究对象，前列腺增生患者平均年龄(73.58±5.88)岁，前列腺癌化疗的患者骨转移者43例，骨及内脏转移者7例，平均年龄(75.22±5.61)岁。前列腺癌化疗患者的纳入标准：①初诊时有明确的经前列腺穿刺活检或手术标本确诊为前列腺癌的病理报告；②行全身骨扫描，胸、腹部CT检查明确有骨和(或)内脏转移者，M分期为Mlb、Mlc的转移患者；③均经过药物或手术去势后出现前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)缓解一段时间后再升；④均有明确初始PSA值及化疗前PSA值；⑤确诊时具有以Gleason评分为标准的前列腺癌病理分级；⑥患者均符合mCRPC，剔除行二线内分泌或其他治疗方法，均行多西他赛联合泼尼松全身化疗方案者。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA的提取

化疗开始前，利用EDTA管收集外周血样10 mL。将样品在4 ℃保存最多2 h直至处理。用吸管小心加到相对体积质量为1.072的淋巴细胞分离液的离心管液面上。离心后，分离外周血单核细胞，并使用TRI-Reagent(美国赛默飞世尔科技公司)根据制造商的说明提取总RNA。通过ND-1000分光光度计(美国Nanodrop 科技公司)定量RNA。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

使用High Capacity cDNA Archive Kit(美国赛默飞世尔科技公司)对0.5 μg总RNA进行反转录。使用TaqMan PreAmp Master Mix Kit(美国赛默飞世尔科技公司)，将T-E和管家基因GUSB预扩增14个循环，不同的是反应的最终体积减少至12.5 μL。在StepOne Plus实时PCR系统(美国Life科技公司)中进行qRT-PCR。使用SDS软件1.4获取数据。扩增反应一式两份进行。表达值基于靶基因相对于GUSB内源基因的Cq的定量循环(Cq)。商业引物和探针用于扩增T-E和GUSB基因(分别为Hs03063375_ft和Hs99999908_m1; 美国赛默飞世尔科技公司)。本研究分别使用T-E和GUSB的阈值0.1和0.2来记录Cq数据。

1.2.3T-E分类

当在一式两份反应中检测到T-E基因和管家基因GUSB(Cq≤35)时，患者归类为T-E阳性。 当可检测到GUSB但未检测到T-E(未确定的Cq)时，患者归类为T-E阴性。

1.3 随访和评估

每3～6周测量PSA浓度，并且每2～4个月或根据临床情况进行CT和/或骨扫描检查。 PSA反应率定义为在治疗开始后的任何时间PSA从基线(维持>4周)至少减少50%。 PSA-无进展生存期(progression free survival,PFS)，放射学无进展生存期(radiological progression free survival, RX-PFS)和总生存期(overall survival,OS)分别为从服用多西他赛开始计算到PSA进展，放射学进展和死亡或最后一次随访时。 治疗反应标准和疾病进展性定义遵循前列腺癌临床试验工作组标准[6]。PSA进展定义为PSA值升高较最低值至少增加25%并在3周后确认。放射学进展定义为治疗期间或治疗后骨扫描显示新出现的转移灶≥2个，且在以后 (≥2个月)再次骨扫描时得到确认，则为进展；其他可测量转移灶采用实体瘤的新反应评估标准(RECIST评价标准)[7]，比较治疗前后的CT或MRI检查结果。患者随访时间直至死亡或最后一次就诊。PSA倍增时间(PSA doubling time, PSADT)定义为化疗前PSA达到最低值后再次测量PSA增2倍需要的时间。

1.4 统计学方法

2 结果

在20例前列腺增生患者中未检测到T-E融合基因。在50例多西他赛化疗的mCRPC患者外周血中，10例(20.0%)检测为T-E阳性，40例(80.0%)为阴性。根据T-E表达对患者进行分组，除初始PSA、PSADT、激素敏感时间外，mCRPC患者的基线特征，差异无统计学意义(P>0.05,表1)。

表1T-E融合基因阳性与阴性组之间的肿瘤特征

FactorsT-E negative(n=40)T-E positive(n=10)tPFactors at diagnosis Age/a74.89±5.0176.25±7.560.16 PSA/(ng·mL-1)45.07±36.0481.86±135.920.02Gleason score0.010.94 ≤7276 >7134Factors at the start of chemotherapyPSADT/month27.53±17.6819.43±12.570.06ECOG score0.200.66 091 ≥1319Hormone sensitive time/month32.82±21.0521.05±15.120.04WBC/(109×L-1)6.89±4.736.57±4.140.71HB /(g·L-1)117.24±31.35112.31±34.640.67

T-E:TMPRSS2-ERG;PSA: prostate specific antigen;PSADT: prostate specific antigen doubling time;ECOGscore: Eastern Cooperative Oncology Group;WBC: white blood cell;HB:hemoglobin.

T-E阳性患者的PSA反应率低于阴性患者(分别为32.52%和74.35%，P=0.040)(图1)。T-E阳性患者的PSA-PFS，RX-PFS和OS低于阴性患者，差异均有统计学意义(图2～4)。

图1 T-E PSA反应率Fig.1 PSA response rate in T-E T-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

图2 PSA无进展生存期Fig.2 PSA progession free survivalT-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

图3 T-E患者的放射学无进展生存期 Fig.3 RX-PFS in T-E positive and negative patientsT-E: TMPRSS2-ERG;RX-PFS:radiologic progression-free survival.

图4 总生存期 Fig.4 Overall survivalT-E: TMPRSS2-ERG.

多因素Cox分析结果显示，Gleason评分、PSADT、激素敏感时间、T-E与PSA-PFS，RX-PFS和OS相关(P<0.05),HB与OS相关(P<0.05)，详见表2。

表2 mCRPC患者PSA-PFS，RX-PFS和OS的多因素Cox回归分析

mCRPC:metastatic castration resistant prostate cancer;PSA:prostate specific antigen;PFS:progression free survival;RX-PFS:radiological progression free survival;OS: overall survival;PSADT:prostate specific antigen doubling time;ECOG:Eastern Cooperative Oncology Group;WBC:white blood cell;HB:hemoglobin.

3 讨论

我国PSA筛查存在地区差异，高危进展性及转移性前列腺癌(metastatic prostate cancer，mPC)患者所占比例较高[8-9]。肿瘤耐药是导致前列腺癌化疗失败的重要原因。

基因融合是指基因在染色体上发生位置错位、 融合的现象，从而产生新的融合基因，该基因可能具有新的功能。T-E基因融合是前列腺癌中已知最常见的遗传改变。T-E融合基因的发生率在不同人种之间存在明显差异。欧美几个研究中心样本量超过500例的研究[10]显示T-E融合基因发生率约为50%。陶晶等[11]、Qi等[12]及Dong等[13]在前列腺癌组织中T-E融合基因检出率分别为19.8%、23.2%、14.3%。

在本研究中，20%的mCRPC患者检测到T-E融合基因。分析融合基因与临床结果的关系时，发现T-E融合基因阳性患者在多西他赛化疗后PSA-PFS，RX-PFA和OS低于阴性组。这些结果表明T-E融合基因是预测mCRPC患者多西他赛化疗耐药的潜在生物标志物。这与当前部分结果研究一致。在Galletti等[14]的1项研究中，11例(32.4%)患者T-E融合阳性，ERG表达阳性患者对多西他赛的PSA反应率与阴性相比,差异有统计学意义(阳性45%vs阴性79%，P<0.05)。此外，Reig等[15]报道，50例多西他赛治疗的mCRPC患者中有8例(16%)外周血中T-E融合基因阳性。这一发现也与较低的PSA反应率：PSA-PFS、C/R-PFS和OS相关。研究[16]显示外周血中检测到的ERG表达与用多西他赛化疗的mCRPC患者较低的PSA-PFS、C/R-PFS和OS相关。

目前关于T-E融合基因与前列腺癌化疗耐药的具体机制还没有明确。Galletti等[14]证明ERG与可溶性微管蛋白结合并降低紫杉烷-微管蛋白相互作用，导致紫杉烷敏感性受损。此外，T-E诱导上皮-间质转化，这也与CRPC中的紫杉烷抗性有关[17]。

本研究虽然显示T-E融合基因与前列腺癌化疗耐药有关，但是样本量相对较小，而且融合基因阳性的患病率不高。同时这也是一个单中心的试验，可能对患者选择有偏倚。下一步需要更大量的样本及多中心的研究进一步明确两者之间的关系。

总之，本研究的结果表明，T-E融合基因的表达与多西他赛化疗的mCRPC患者中较低的PSA-PFS、RX-PFS和OS相关。因此，它们可以用作预测mCRPC患者中多西紫杉醇治疗的潜在生物标志物。