LINC00473调控miR-210/TET2分子轴对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响

唐飞 甘露 吕仲平

白内障会降低老年人生活质量，给患者带来巨大的经济和精神负担，已成为全球重大的公共卫生问题[1]。既往研究显示，人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,hLECs)凋亡是白内障发生的病理基础，而氧化应激损伤是导致hLECs凋亡的主要危险因素[2]。探讨hLECs增殖、凋亡和氧化应激损伤的分子机制对防治白内障意义重大。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸且无蛋白编码潜能的RNA转录本。最近研究表明，lncRNA参与细胞增殖、凋亡、氧化应激损伤等多种病理生理过程，在眼部正常发育中起着重要作用[3-4]。LINC00473是位于染色体6q27位点的基因间lncRNA，其参与宫颈癌[5]、胰腺癌[6]等多种肿瘤细胞生长、存活的调控，沉默LINC00473可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，LINC00473还可调控滋养细胞的增殖和凋亡，与子痫前期的发生发展有关[7]。然而，目前未见LINC00473与hLECs的相关报道。H2O2可诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡，是研究白内障常用的体外细胞模型的建立方法[8-9]。因此，本研究通过检测LINC00473在H2O2诱导的hLECs中的表达水平，初步揭示其调控细胞增殖、凋亡以及氧化应激损伤的分子机制，以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料hLECs SRA01/04细胞购于上海拜力生物科技有限公司；DMEM低糖培养基、胎牛血清和青霉素、链霉素溶液购于美国Hyclone公司；H2O2购于美国Sigma公司；LipofectamineTM2000、TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、P21、10-11易位酶2(ten-eleven trantranslocation 2，TET2)抗体以及山羊抗兔IgG购于美国Abcam公司；pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1、si-NC、si-LINC00473、si-TET2、miR-NC、miR-210mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210、WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2由上海吉玛制药公司提供；cDNA合成试剂盒、SYBR Green Realtime PCR试剂盒购于日本Toyobo公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购于上海贝博生物；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)活性检测试剂盒购于北京索莱宝科技公司。

1.2 细胞培养和模型构建SRA01/04细胞采用DMEM低糖培养基(含体积分数10%胎牛血清和10 g·L-1青-链霉素)在37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱内培养。当细胞融合度达90%时消化传代。细胞培养液内加入100 μmol·L-1H2O2后于培养箱内培养24 h，建立H2O2细胞损伤模型。

1.3 细胞分组处理将SRA01/04细胞按照每孔200×103个细胞接种于6孔板，当细胞融合度达到50%时按照脂质体转染试剂LipofectamineTM2000说明书将pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1分别转染至SRA01/04细胞，经H2O2诱导后，依次标记为H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组、H2O2+pcDNA3.1组。同时设置Con组(正常对照组)、H2O2组(仅建立H2O2细胞损伤模型)。

1.4 实验方法收集细胞，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况， CCK-8法检测各组细胞存活率，严格按照试剂盒说明书步骤检测各组细胞中MDA含量以及SOD、GSH-Px活性。 同时进行以下实验。

1.4.1 集落形成实验将对数生长期的各组细胞按照每孔200个接种于6孔板，米字型方向轻轻晃动平板使细胞分散均匀，培养7 d后观察细胞生长情况，当出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，弃去细胞培养基，固定和染色后，显微镜下观察拍照，计算克隆形成数。实验重复3次。

1.4.2 RT-qPCR检测利用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，以cDNA第一链合成试剂盒逆转录合成cDNA，利用SYBR Green Realtime PCR试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH为内源性参照，运用2-ΔΔCt法分析LINC00473的表达水平。引物序列为：LINC00473上游引物:5’-GATGGAAAGGAGGGAAGG-3’，下游引物:5’-CACAGTGGGTCCAGGGTT-3’；GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物:5’-GATGGCAACAATATCCACTT-3’。

1.4.3 Western blot检测收集各组细胞获得细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，按照每泳道 40 μg 蛋白样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用湿法转膜将已分离的细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜，洗膜后，将膜置于50 g·L-1脱脂牛奶中封闭1 h，洗膜后将膜置于稀释的一抗(Caspase-3为1500，P21为11000,TET2为1250)溶液中室温孵育2 h，洗膜后，将膜置于稀释的二抗(12000)溶液中室温孵育1 h。加入化学发光试剂避光显色后，Quantity One软件分析蛋白表达水平。

1.4.4 双荧光素酶报告基因实验等线生物信息学分析工具starBase进行靶基因预测，发现LINC00473与miR-210之间存在结合位点，targetscan进行靶基因预测，发现miR-210与TET2之间存在结合位点，采用双荧光素酶报告基因实验验证LINC00473与miR-210、miR-210与TET2靶向调控关系。将WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2分别与miR-NC、miR-210 mimics共转染至SRA01/04细胞，转染48 h后，测定各组细胞荧光素酶活性。同时将pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00473、si-NC、si-LINC00473分别转染hLECs SRA01/04细胞，以U6为内参， 参照1.4.2方法检测miR-210的表达水平。将miR-NC、miR-210 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210分别转染SRA01/04细胞，以GAPDH为内参，参照1.4.2方法检测TET2的表达水平。引物序列为：miR-210上游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游引物：5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；TET2上游引物：5’-TAAGTGGGTGGTTCGCAGA-3’，下游引物：5’-TCCGAGTAGAGTTTGTCAGCC-3’。

1.4.5 LINC00473调控miR-210/TET2分子轴影响H2O2诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤为验证LINC00473是否通过调控miR-210/TET2分子轴进而影响H2O2诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤，将pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC、pcDNA3.1-LINC00473+miR-210、pcDNA3.1-LINC00473+si-NC、pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2分别转染SRA01/04细胞，经H2O2诱导后，再次检测细胞存活率、凋亡率、克隆形成数、MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

2 结果

2.1 LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞的影响与Con组比较，H2O2组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显著降低，Caspase-3和P21蛋白的表达显著升高，细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与H2O2+pcDNA3.1组比较，H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显著升高，Caspase-3和P21蛋白的表达显著降低，细胞克隆形成数显著增加，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Con组比较，H2O2组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与H2O2+pcDNA3.1组比较，H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1和表2。

2.2 LINC00473靶向调控miR-210starBase预测发现，LINC00473与miR-210之间存在部分连续互补的核苷酸序列，见图1。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-NC和WT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(0.36±0.03)较miR-210 mimics和WT-LINC00473共转染组(0.96±0.10)显著降低(P<0.05)；miR-NC和MUT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(1.04±0.10)与miR-210 mimics和MUT-LINC00473共转染组(0.99±0.10)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR检测结果显示，上调LINC00473表达后，SRA01/04细胞miR-210的表达水平(0.23±0.02)较正常SRA01/04细胞(1.00±0.10)显著降低(P<0.05)；干扰LINC00473表达后，SRA01/04细胞miR-210的表达水平(2.11±0.22)较正常SRA01/04细胞显著升高(P<0.05)。以上结果表明,LINC00473靶向负调控miR-210表达。

表1 各组细胞中LINC00473的表达及Caspase-3和P21蛋白表达情况

组别LINC00473Caspase-3P21Con组1.02±0.100.21±0.020.24±0.02H2O2组0.30±0.03∗0.75±0.07∗0.89±0.09∗H2O2+pcDNA3.1组0.27±0.030.78±0.070.92±0.09H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组0.88±0.08#0.30±0.03#0.35±0.03#

注：与Con组比较，*P<0.05；与H2O2+pcDNA3.1组比较，#P<0.05

表2 LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px、MDA表达的影响

组别克隆形成数细胞存活率/%细胞凋亡率/%SOD/U·mL-1GSH-Px/U·mL-1MDA/nmol·mL-1Con组146.01±13.22100.16±10.218.16±1.0188.25±5.57167.27±13.5752.11±4.53H2O2组64.04±6.53∗46.68±4.69∗27.83±2.57∗37.26±2.18∗101.34±9.85∗97.26±8.84∗H2O2+pcDNA3.1组62.29±6.4747.02±4.6728.10±2.6237.10±2.1399.26±8.6796.55±8.63H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组130.13±12.68#91.24±9.35#13.58±1.41#71.34±4.38#149.26±12.68#61.14±5.37#

注：与Con组比较，*P<0.05；与H2O2+pcDNA3.1组比较，#P<0.05

图1 LINC00473靶向miR-210

2.3 过表达miR-210逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-NC组SRA01/04细胞中miR-210(1.01±0.10)、Caspase-3蛋白(0.31±0.03)和P21蛋白(0.38±0.04)表达比较，H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-210组SRA01/04细胞miR-210(1.89±0.17)、Caspase-3蛋白(0.66±0.07)和P21蛋白(0.79±0.08)的表达水平均显著升高。与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组相比，H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组的细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，SOD和GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表3。

表3 过表达miR-210及抑制TET2对SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

组别克隆形成数细胞存活率/%细胞凋亡率/%SOD/U·mL-1GSH-Px/U·mL-1MDA/nmol·mL-1H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组127.22±12.4690.44±9.3214.13±1.4270.68±4.42151.13±13.1060.95±5.53H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组77.31±7.58∗53.36±5.40∗25.12±2.55∗44.68±2.67∗122.37±11.17∗83.55±7.84∗H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组129.03±12.5190.84±9.2713.96±1.4070.52±4.38150.97±12.8961.03±5.49H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2组68.12±7.03#49.26±4.77#27.14±2.62#39.46±2.37#108.65±10.03#91.34±8.25#

注：与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组比较，*P<0.05；与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组比较，#P<0.05

2.4 miR-210靶向调控TET2miR-210与TET2之间存在部分连续互补的核苷酸序列，见图2。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-NC和WT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(0.33±0.03)较miR-210 mimics和WT-TET2共转染组(0.94±0.09)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-NC和MUT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(1.00±0.10)较miR-210 mimics和MUT-TET2共转染组(0.96±0.09)变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR和Western blot检测结果显示，上调miR-210表达后，SRA01/04细胞TET2 mRNA(0.34±0.03)和蛋白(0.20±0.02)的表达水平均较正常SRA01/04细胞TET2 mRNA(1.01±0.10)和蛋白(0.61±0.06)的表达水平显著降低；下调miR-210表达后，SRA01/04细胞TET2 mRNA(1.88±0.18)和蛋白(1.45±0.15)的表达水平均较正常SRA01/04细胞显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。提示miR-210靶向负调控TET2表达。

图2 miR-210靶向TET2

2.5 抑制TET2逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组TET2质粒(0.88±0.08)、Caspase-3蛋白(0.29±0.03)、P21蛋白(0.37±0.03)表达比较，H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组SRA01/04细胞TET2质粒(0.24±0.02)表达显著降低，Caspase-3蛋白(0.72±0.07)和P21蛋白(0.85±0.08)表达均显著升高。与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组相比，H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，SOD和GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高(均为P<0.05)，见表3。

3 讨论

白内障是全球致盲的主要眼病之一，全球约50%的失明患者是由白内障引起的[10]。晶状体是由单层上皮细胞构成的透明器官，氧化应激引起的hLECs损伤和凋亡是引发白内障的主要原因。本研究通过H2O2诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡，探索与其相关的基因，以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。

LINC00473是乳腺癌预后的独立影响因素，其高表达与乳腺癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后较差有关，抑制LINC00473表达可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[11]。LINC00473在胶质瘤中表达上调，干扰LINC00473可抑制胶质瘤细胞的增殖和肿瘤生长，抑制胶质瘤进展[12]。本研究结果表明，H2O2诱导后SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显著降低，P21的表达显著升高，LINC00473的表达水平显著降低；上调LINC00473表达后，SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显著升高，说明上调LINC00473表达可提高SRA01/04细胞的增殖能力。正常机体内存在SOD、GSH-Px等抗氧化酶防御系统，可清除自由基，保护机体免受氧化应激损伤，维持机体正常代谢活动。本研究结果显示，H2O2诱导后SRA01/04细胞脂质过氧化产物MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px的活性显著降低，而上调LINC00473可显著降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性。因此，LINC00473可抑制H2O2诱导的SRA01/04细胞氧化应激损伤。同时本研究结果显示，H2O2诱导后SRA01/04细胞中Caspase-3的表达水平显著升高，细胞凋亡率显著增加，而上调LINC00473可抑制H2O2诱导的细胞凋亡。以上结果表明，上调LINC00473可促进细胞增殖，抑制H2O2诱导的氧化应激损伤和凋亡，进而对SRA01/04细胞发挥保护作用。

有研究表明，miRNA异常表达与晶状体发育、LECs的凋亡、晶状体透明度降低以及白内障的发生关系密切[13]。为探讨LINC00473对SRA01/04细胞的保护作用机制，本研究通过序列分析发现，miR-210是LINC00473的潜在功能性靶基因之一。miR-210在hLECs氧化损伤中表达上调，且其在年龄相关性白内障患者晶状体组织中亦是高表达，miR-210高表达可促进LECs凋亡[14-15]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实，LINC00473靶向负性调控miR-210表达，过表达miR-210可逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡以及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。

TET2是TET蛋白家族成员之一。有研究显示，TET2参与病理条件下神经元细胞存活过程，上调TET2对氧化应激介导的神经元损伤的细胞保护作用[16]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-210可靶向负性调控TET2表达，进一步研究显示，抑制TET2表达能逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。提示LINC00473通过调控miR-210/ TET2分子轴可减轻H2O2诱导的hLECs氧化应激损伤和凋亡。

综上所述，LINC00473在H2O2诱导的hLECs中表达下调，上调LINC00473表达通过调控miR-210/TET2分子轴可促进细胞增殖，抑制H2O2诱导的氧化应激损伤和凋亡，进而对hLECs发挥保护作用，为基于hLECs防治白内障提供了新的方向。