ROS信号通路调控NLRP3炎症小体在自身免疫性葡萄膜炎发生中的作用△

王俞方 肖启国 王智 周俊 郑芳

葡萄膜炎是一类葡萄膜、视网膜和玻璃体发生的炎症性疾病，严重者可致盲，以青壮年多发，致病机制更多与自身免疫功能紊乱和炎症反应异常有关[1]，眼组织发生不可逆损害。葡萄膜炎患者房水中T和B淋巴细胞数量增加，单核吞噬系统和中性粒细胞的溶酶体功能亢进，提示葡萄膜炎的发病涉及体内免疫系统的激活[2]。葡萄膜炎患者中可检测出抗葡萄膜抗体，病情严重者更加明显。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor，NLRP3)炎症小体属于模式识别受体，结构上具有高度保守性，是由核心蛋白NLRP3、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、效应蛋白pro-Caspase-1构成的复合体。已有研究表明[3-4]，部分葡萄膜炎(VKH、Behcet病)患者外周静脉血中可见NLRP3表达，NLRP3 炎症小体被超活化，白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18生成增加；NLRP3基因突变小鼠自身炎症反应明显减弱。表明NLRP3炎症小体在葡萄膜炎的发生中发挥重要作用，但关于 NLRP3炎症小体及下游因子在葡萄膜炎眼内活体组织中的表达国内外鲜有报道。

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是细胞内外代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物总称，主要通过与硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)反应，从硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)中释放，激活 NLRP3炎性小体。自身免疫性炎症反应是葡萄膜炎发生的核心要素，通过ROS信号通路激活NLRP3炎症小体，从而引发一系列炎症反应。本研究旨在阐明自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis,AU)的发病机制，为寻求新的药物治疗靶点提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料选择健康2月龄Lewis大鼠共40只，雌雄不限，体质量235～275(250±25)g，适应性饲养1周，随机分为空白对照组、模型组、空载体转染组(空载体组)和NLRP3-shRNA沉默组(沉默组)，每组各10只。主要试剂：NLRP3基因shRNA序列和转染质粒(Invitrogen公司)，慢病毒载体(Sigma公司)，NLRP3、IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒(R&D公司)，免疫组织化学试剂盒(Media Cybernetics公司)，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18抗体(Media Cybernetics公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，cDNA 试剂盒(Promega公司)，PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems公司)，BCA蛋白提取试剂盒(Pierce公司)，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18，TRX和TXNIP抗体(Sigma公司)。主要仪器：手术显微镜(Olympus公司)，PCR扩增仪(Applied Biosystems公司)，电泳仪(GE公司)。

1.2 构建实验性AU大鼠模型模型组、空载体组和沉默组构建AU模型。首先将视网膜S抗原(HS-Ag P35)冻干粉配成4 g·L-1溶液，与等量完全弗氏佐剂(CFA)混合至膏状乳剂；然后取0.1 mL混合乳化剂注射大鼠双后足垫、双后腿及背部皮下，1周后再次同法免疫1次。第2天将450 mg·L-1伤寒杆菌内毒素0.5 μL于大鼠睫状体平坦部进针行玻璃体内注射，成功建立AU大鼠模型，裂隙灯下观察右眼眼前节炎症反应并量化评分。参照Caspi方法分为0～4分，评分越高，炎症反应越强。

1.3 NLRP3沉默技术由Invitrogen公司设计4对大鼠NLRP3基因shRNA序列，对应构建4种pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-shRNA质粒，筛选NLRP3基因干扰效率最高的质粒，包含shRNA序列3条。随后将干扰效率最好的shRNA序列构建入pDONR221-EmGFP-NLRP3-shRNA重组穿梭质粒，重组成慢病毒载体pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-shRNA，进一步包装慢病毒，大鼠经多次颈静脉注射空载体或慢病毒载体，剂量为每只100×106TU，感染时间为72 h。空载体组和沉默组随机抽取1只大鼠处死，取视网膜组织行冰冻切片，检测病毒转染效率。

1.4 观察指标模型成功后10 d、13 d、16 d、19 d采集大鼠左眼房水，模型成功后12 d、20 d处死大鼠制备视网膜组织切片，分别采用ELISA、免疫组织化学、实时定量PCR和Western blot法检测NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP的表达。

1.4.1 ELISA法测量所有大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18的表达大鼠房水采集：大鼠经100 g·L-1水合氯醛5 mL和奥比卡因12.5 mg·kg-1(6 mL)麻醉后，手术显微镜下将针头刺入左眼，房水自动吸入毛细管，房水收集于无菌 EP 管中，-80 ℃ 冷冻保存。按照 ELISA 试剂盒步骤，酶标仪测定各组大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18表达水平。空白孔加生物素化抗体稀释液，36 ℃避光孵育30 min，然后各孔加入酶结合物，36 ℃避光、TMB显色，检测波长450 nm处的吸光度(A)值。

1.4.2 免疫组织化学法测量所有大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18表达制作视网膜石蜡切片，厚约 4.0 μm。常规 HE 染色，封片，显微镜下观察，炎症反应参照 Caspi 方法分为0～4分，其中0分为无炎性细胞浸润，正常视网膜结构；0.5分为少量细胞浸润，视网膜损伤范围<1/4；1分为视网膜光感受器外节炎性细胞浸润，损伤范围≥1/4；2分为中度炎性细胞浸润达外核层，损伤范围≥1/4；3分为视网膜脉络膜上广泛炎性细胞浸润达内界膜，损伤范围≥1/4；4分为视网膜脉络膜上极重度炎性细胞浸润，伴全层视网膜浸润，损伤范围≥1/4。

采用免疫组织化学SP 法染色，参照试剂盒说明步骤进行，先后滴加兔抗大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18一抗(12500)过夜孵育，洗涤后加入生物素标记二抗(1500)37 ℃避光孵育4 h，洗涤加入链亲和素-过氧化物酶溶液，DAB显色。结果采用半定量法，以细胞核或细胞浆黄染为阳性细胞，染色强度和阳性细胞百分比分别赋值0～3分和0～5分，两项乘积大于3分为阳性，小于3分为阴性。

1.4.3 PCR法测量所有组别大鼠中NLRP3 mRNA水平采用Trizol试剂提取各组大鼠视网膜组织总RNA，逆转录合成cDNA，加入正向和反向引物以及SYBR后，实时定量PCR进行扩增。NLRP3上游引物：5’-GTGCAGATCCTAGGTTTCTCTG -3’、下游引物：5’- CAGGATCTCATTCTCTTGG ATC-3’，大小为125 bp;内参β-actin上游引物：5’- AGACCTTCAACACCCCAG-3’、下游引物：5’- CACGATTTCCCTCTCAGC-3’，大小为101 bp。结果以2-ΔΔCt表示。

1.4.4 Western blot测量各组大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP蛋白表达采用BCA蛋白提取试剂盒获取各组大鼠视网膜组织总蛋白，与等体积2×SDS上样缓冲液充分混匀水浴；取20 μL样品蛋白进行SDS-PAGE，然后转印至硝酸纤维素膜上；依次加入兔抗鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP一抗(11500)过夜孵育，洗膜后加入HRP标记二抗(1500)37 ℃避光孵育4 h，ECL显影，结果以目标蛋白与参照蛋白条带比值表示各种蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法利用SPSS 20.0统计软件对多组间计量资料作单因素ANOVA分析，多个时间点计量资料作重复测量的方差分析，多组间计数资料作χ2分割检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 模型鉴定各组大鼠均能存活至各个观察时间点，饮食和体质量基本相当，模型组、空载体组和沉默组大鼠活动量稍减少。裂隙灯下观察眼前节炎症反应评分发现，模型组[(3.3±0.4)分]、空载体组[(3.3±0.3)分]和沉默组[(3.4±0.4)分]的评分均显著高于空白对照组[(0.3±0.1)分]，差异均有统计学意义(t=12.326、12.562、14.528，均为P<0.001)；模型组、空载体组和沉默组比较，差异无统计学意义(F=0.562，P>0.05)。

2.2 ELISA检测结果ELISA结果发现，模型组和空载体组造模成功后10 d、13 d、16 d、19 d大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18水平显著高于沉默组，空白对照组最低(P<0.05)。见表1。

组别NLRP3/μg·L-110d13d16d19dIL-1β/μg·L-110d13d16d19dIL-18/μg·L-110d13d16d19d空白对照组1.3±0.31.5±0.31.6±0.41.4±0.33.5±0.63.6±0.73.7±0.83.5±0.53.1±0.93.2±0.83.3±0.93.1±0.6模型组9.6±2.510.2±2.612.5±2.912.8±3.234.5±6.939.7±9.344.5±11.245.2±12.331.2±6.736.9±7.241.2±8.542.3±8.8空载体组9.3±2.79.8±2.911.4±3.111.8±3.233.2±9.537.8±10.242.3±12.343.6±14.529.8±6.935.6±7.539.8±8.241.3±8.5沉默组5.5±2.16.4±2.57.9±2.88.3±2.420.5±7.426.8±9.333.5±13.435.6±13.915.6±5.918.9±6.523.5±7.725.6±8.2F值5.6396.9877.5237.85615.23616.32820.23517.52420.23625.63931.23535.639P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.3 免疫组织化学检测结果免疫组织化学检测结果发现，模型组和空载体组造模成功后12 d和20 d大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18阳性表达率显著高于沉默组，空白对照组最低(均为P<0.05)。见表2和图1。

表2 各组大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18阳性表达率 [例(%)]

图1 各组大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫组织化学检测结果

2.4 各组PCR结果PCR结果发现，模型组和空载体组大鼠造模成功后12 d和20 d视网膜中NLRP3 mRNA表达水平显著高于沉默组，空白对照组最低(均为P<0.05)。见表3。

表3 PCR法测量各组大鼠视网膜中NLRP3 mRNA表达水平

组别12 d20 d空白对照组0.056±0.0120.075±0.022模型组0.452±0.1210.523±0.142空载体组0.433±0.1060.506±0.136沉默组0.256±0.0890.345±0.102F值123.235156.569P值0.0000.000

2.5 Western blot检测结果Western blot检测结果发现，模型组和空载体组造模成功后12 d和20 d视网膜组织中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP相对表达水平显著高于沉默组，空白对照组最低(P<0.05)。见图2和图3。

图2 各组大鼠视网膜组织中各种蛋白相对表达量

图3 各组大鼠造模后不同时间视网膜组织中各种蛋白表达

3 讨论

葡萄膜炎根据病因可分为感染性和非感染性两类，非感染性更多见，主要由T淋巴细胞介导自身免疫反应。葡萄膜中含有丰富的血管结构和色素组织，许多全身免疫疾病的介质经血液循环在此沉积，因此葡萄膜成为自身免疫性炎症的好发部位[5]。人眼组织中含有大量的自身抗原，通常这些抗原不会诱发自身免疫反应；病理情况下机体自身免疫耐受性被破坏，易导致自身免疫性疾病的发生。

该研究通过构建实验性AU大鼠模型，经裂隙灯下观察眼前节炎症反应评分发现，模型组、空载体组和沉默组的评分均显著高于空白对照组(均为P<0.05)，符合AU病理改变，此处观察到沉默组的炎症反应与模型组接近，考虑沉默组只是针对单一途经进行干预，影响AU的发病机制可能更为复杂；此外，炎症评分较为主观，并不能反映客观的炎症强度。本研究发现，模型组和空载体组造模成功后10 d、13 d、16 d、19 d，大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18水平均显著高于沉默组，空白对照组最低(P<0.05)。ASC是相对分子质量约22 000的接头蛋白，由PYD和CARD组成，主要分布于人单核/巨噬细胞核，应激时迅速转移至细胞浆，连接NLRP3和 pro-Caspase-1，促进 NLRP3炎症小体激活[6]。活化的NLRP3通过自身分子结构上特定位点与ASC相结合，进而借助CARD-CARD相互作用方式呈放大倍数激活pro-Caspase-1，其主要功能是将无活性的IL-1β 和IL-18前体物质组装成具有活性的成熟体，最终发挥对应的炎症反应，介导葡萄膜细胞的损伤和修复延迟[7-8]。

本研究免疫组织化学检测结果发现，模型组和空载体组造模成功后12 d和20 d大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18阳性表达率显著高于沉默组，空白对照组最低(均为P<0.05)。在多种免疫反应中，成熟的 IL-1β 是有效的促炎介质，能将先天性免疫细胞招募至感染部位，调节获得性免疫细胞。以类风湿性关节炎患者为研究对象发现，患者血清和关节液中IL-1β水平显著高于正常健康人群，健康志愿者关节滑液中仅可检测到微量的IL-1[9-10]。成熟的 IL-18 能够促进γ干扰素(IFN-γ)生成，增强自然杀伤细胞和T细胞的杀伤活性，同时刺激Th1和Th2型免疫反应[11-12]。研究发现[13-14]，玻璃体内注射一定量IL-1，视网膜毛细血管通透性增高，色素上皮细胞间紧密连接开放，导致眼内血-视网膜屏障破坏，诱发实验性葡萄膜炎。而IL-1 抑制剂能够抑制免疫介导的炎症反应，改善实验性AU的炎症反应强度。

本研究中PCR结果发现，模型组和空载体组造模成功后12 d和20 d大鼠视网膜中NLRP3 mRNA水平显著高于沉默组，空白对照组最低(均为P<0.05)。Western blot结果发现，模型组和空载体组造模成功后12 d和20 d大鼠视网膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP相对表达水平显著高于沉默组，空白对照组最低(均为P<0.05)。有研究发现，影响葡萄膜炎发生和发展的主要信号通路学说有P2X7受体、溶酶体和ROS依赖途径三种，其中更多学者认为ROS可能发挥主要作用[15]。ROS主要通过与TXNIP反应，从TRX中释放，激活 NLRP3炎性小体[16]。线粒体功能损伤后释放ROS是细胞应激反应的关键环节，也是NLRP3炎症小体活化的关键信号[17]，细胞内加入ROS抑制剂Trolox后，细胞内Caspase-1和IL-1β水平明显下降[18]。TRX系统在调节细胞内氧化还原稳态以及信号通路方面发挥重要作用，TXNIP主要通过调控抗氧化TRX表达，时间依赖性与TRX解离，与NLRP3蛋白结合，完成炎症小体的组装活化[19]。细胞内过表达的TXNIP可增加细胞内ROS水平[20]。

综上所述，NLRP3炎症小体及下游炎症因子表达上调可能参与了AU的发生，并介导ROS信号通路发挥作用。