沙格列汀联合二甲双胍对老年2型糖尿病患者外周血炎性因子及单个核细胞NLRP3炎性体mRNA表达的影响

陈仲钰，俞晓芳，解正林

南京鼓楼医院集团仪征医院内分泌科(江苏 仪征 211900)

糖尿病(DM)是世界范围内高发慢性病，容易出现糖尿病微血管病变、周围神经病变(DN)、糖尿病肾病等严重并发症，且与高血压、冠心病等心脑血管疾病密切相关，与肝脏疾病等伴发时将增加医院感染及手术风险[1]。近年来，随着我国人口老龄化加剧及肥胖症发病率的升高，DM发病率呈显著升高趋势，且以2型糖尿病(T2DM)居多。近期研究表明，免疫细胞活化所致慢性低度炎症与T2DM的发生及发展密切相关[2]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白-3(NLRP3)是NOD样受体(NLRs)家族重要成员之一，在炎性相关性疾病或组织损伤中具有重要作用，NLRP3活化及其所驱动的促炎因子成熟、分泌与T2MD有关，抑制NLRP3激活及其所致炎症反应可能对T2MD的治疗具有积极意义[3]。相关研究证实[4]，二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂沙格列汀与二甲双胍联用能够提高血糖控制效果，但其机制仍不明确。本研究观察沙格列汀联合二甲双胍对老年T2DM患者糖代谢异常的影响，并观察外周血炎性因子及单个核细胞(PBMCs)中NLRP3炎性体mRNA表达量的变化，现报道如下：

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年1月-2019年1月南京鼓楼医院集团仪征医院收治的老年T2DM患者90例为研究对象。纳入标准：①符合《中国T2DM防治指南(2013年版)》[5]中对T2DM的诊断标准；②年龄>60岁；③精神状态及智力状态正常，能够配合临床试验。排除标准：①1型DM患者；②出现严重感染、糖尿病酮症酸中毒、中重度贫血者；③合并类风湿性关节炎、慢性心力衰竭、恶性肿瘤及其他严重疾病者；④合并严重肝肾功能障碍者；⑤本研究用药禁忌或过敏者。患者按照随机数字表法分为观察组与对照组，每组45例。两组性别、年龄、病程、合并症、入院原因等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。患者均自愿参与本次研究且签署知情同意书，研究设计获得医院伦理委员会审核批准。

表1 两组患者一般资料比较

1.2治疗方法两组均给予DM饮食、适当运动，针对性予以降压、调脂等对症治疗。在此基础上对照组给予盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023371，规格0.85 g/片)口服，0.85g/次，1次/d随餐服用，用药1周后如无明显不适症状或不良反应，按照每2周增加0.85 g的剂量逐步增加剂量至0.85 g/次，3次/d随餐服用。观察组在对照组基础上，加用沙格列汀片(阿斯利康制药有限公司，国药准字J20160069，规格5 mg/片)口服，2.5 mg/次，2次/d。两组均连续用药3个月后评价疗效。

1.3观察指标①一般资料统计：所有患者均在就诊时统计一般资料，包括性别、年龄、病程、吸烟情况、入院原因、合并症等。②血生化检验：治疗前后晨取空腹外周静脉血，采用血糖分析仪测定空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)，采用高效液相色谱法检测糖化血红蛋白(HbAlc)，采用放射免疫分析方法测定空腹胰岛素(FINS)，采用稳态模型法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5，计算胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)=20×FINS/(FPG-3.5)。参照《中国T2DM防治指南》[5]中对T2DM的综合控制目标统计血糖达标情况：FPG为4.4～7.0 mmol/L，2 hPG<10.0 mmol/L，HbAlc<7.0%，BMI<24.0 kg/m2。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清炎性因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A(IL-17A)、白介素-18(IL-18)、白介素-23(IL-23)水平。③NLRP3炎性体mRNA表达检测：治疗前后采集空腹外周静脉血，分离血浆后采用Ficoll-Hypaque密度分离法提取PBMCs，提取总RNA作为模板，逆转录合成cDNA，反应条件为42℃ 50 min→85℃5 min→5℃ 5 min。设计引物实施Real Time-PCR 反应，以β-actin为内参，检测NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表达情况。反应条件：95℃ 10 min→95℃ 30 s→56℃ 30 s→62℃ 45 s，循环10次；然后改为：95℃ 15 s→56℃ 15 s→62℃ 45 s，循环30次，每个样本进行3次测定。相应引物序列：①NLRP3正向引物序列：5’-TGCCCGTCTGGGTGAGA-3’，反向引物序列：5’-CCGGTGCTCCTTGATGAGA-3’，扩增产物86 bp；②凋亡相关性斑点样蛋白(ASC)正向引物序列：5’-CGCGAGGGTCACAAACGT-3’，反向引物序列：5’-TGCTCATCCGTCAGGACCTT-3’,扩增产物88 bp；③半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1正向引物序列：5’-AATTTTCCGCAAGGTTCGATT-3’，反向引物序列：5’-ACTCTTTCAGTGGTGGGCATCT-3’，扩增产物78 bp；④正向引物序列：5’-GCTGTCTGCCTTGGTAGTGGAT-3’，反向引物序列：5’-GCATCGTCACCACCAAAGC-3’，扩增产物82 bp。

2 结果

2.1两组血糖达标情况治疗3个月后，观察组的FPG达标率、2hPG达标率和FPG+2hPG同时达标率均高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组血糖达标情况比较[n=45,n(%)]

2.2两组治疗前后血糖指标比较治疗前，两组HbAlc、FPG、2hPG、HOMA-IR、HOMA-β及BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组HbAlc、FPG、2hPG、HOMA-IR均较治疗前降低，且观察组低于同期对照组，两组HOMA-β均显著升高且观察组高于对照组(P<0.05)；观察组治疗后BMI明显降低(P<0.05)，而对照组变化不显著(P>0.05)(P<0.05)，见表3。

2.3两组治疗前后炎性因子水平比较治疗前，两组血清IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-18及IL-23水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组均较治疗前降低，且观察组低于同期对照组(P<0.05),见表4。

表3 两组治疗前后血糖指标比较

注：与治疗前比较，a：P<0.05；与对照组比较，b：P<0.05。

表4 两组治疗前后炎性因子水平比较

注：与治疗前比较，a:P<0.05；与对照组比较，b:P<0.05。

2.4两组治疗前后PBMCs中NLRP3炎性体mRNA表达量比较治疗前，两组PBMCs中NLRP3mRNA、ASC mRNA及Caspase-1 mRNA表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组均较治疗前明显降低，且观察组低于对照组同期(P<0.05)，见表5。

表5 两组治疗前后PBMCs中NLRP3炎性体mRNA表达量比较

注：与治疗前比较，a:P<0.05；与对照组比较，b:P<0.05。

2.5两组不良反应比较治疗期间，观察组出现恶心2例，低血糖反应2例，呕吐、头痛和乏力各1例，不良反应发生率15.56%(7/45)，对照组出现呕吐2例，恶心、低血糖反应、头痛和乏力各1例，不良反应发生率13.33%(6/45)，两组间不良反应比较差异无统计学意义(χ2=0.090，P=0.764)。

3 讨论

T2MD是一种慢性进展性疾病，疾病进展过程中容易出现多种并发症而增加其危险，早期控制高血糖非常必要。目前，临床尚无特效方案治疗T2DM，多依靠生活方式调节、用药治疗等控制血糖水平并防治相关并发症。二甲双胍是当前应用最多的口服降糖药物之一，其可抑制胃肠道对葡萄糖的摄取，并可提高胰岛素敏感性，提高胰岛素与受体的结合，促进胰岛素对血糖的清除，从而改善糖代谢异常[6]。临床实践表明[7]部分T2MD患者单用二甲双胍难以获得有效的血糖控制，故部分学者主张联合应用2种甚至多种口服降糖药物。

临床研究表明[8]胰升血糖素样肽-1(GLP-1)能够刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而调节血糖水平，还可调节脂质代谢，保护肝肾功能。DPP-4药物沙格列汀能够抑制胰高血糖素的分泌，延缓胃排空，还可延迟肠促胰岛素的失活，有助于降低餐后胰高血糖素的分泌，还能够促进内源性GLP-1的释放[9]。本研究中，观察组应用沙格列汀联合二甲双胍治疗后，FPG、2hPG达标率及两者同时达标率均较对照组明显提高，HbAlc、FPG、2hPG、HOMA-IR较对照组显著降低，而HOMA-β明显高于对照组(P<0.05)，与文献[10,11]报道基本一致，提示沙格列汀联合二甲双胍治疗T2DM相比于单用二甲双胍治疗能够更好地减轻IR并改善胰岛β细胞功能，更好地控制血糖水平，提高血糖控制效果。同时，研究还显示观察组治疗后BMI较治疗前有明显下降，而对照组变化不明显，观察组治疗后BMI明显低于对照组(P<0.05)，认为沙格列汀的应用可能更有利于控制患者的体质量，而肥胖不仅是T2MD的高危因素，也是T2DM糖代谢紊乱及并发症发生的重要危险因素，提示沙格列汀的应用对T2MD及其并发症的防治具有积极意义。刘枘岢等[12]研究显示，对老年T2DM患者应用沙格列汀和二甲双胍进行治疗能够改善血液流变学及血管内皮功能，控制血糖水平，但其机制并不明确。

T2DM与自发性炎症诱发的周围组织胰岛素耐受及胰岛β细胞功能受损密切相关，同时，T2DM因代谢紊乱可诱发或加重炎症反应，从而导致恶性循环，故近年来广泛认为T2DM实际上是一种全身性、低度、慢性炎症状态[13]。NLRP3能够从多途径诱导炎症反应，其炎性体活化后能够诱导前Caspase-1的分裂而生成或花型促酶Caspase-1，后者可诱导IL-1β、IL-18等炎性因子的释放而诱导炎性反应，其余配体可诱导细胞的凋亡[14]。T2DM患者处于慢性炎症状态时，大量内源性损伤相关分子(DAMPs)积累可诱导NLRP3炎性体的活化，诱导ASC集合并招募前Caspase-1并装配产生炎性体，进一步诱导Caspase-1的释放及促炎性因子的裂解，介导炎症反应扩大，而大量促炎性因子作用可损伤胰岛β细胞而导致其功能障碍，诱发T2DM或导致病情加重。同时，NLRP3炎性体过表达在胰岛素耐受中具有重要作用，故其也被认为是葡萄糖内稳态与胰岛素抵抗的调节因子之一[15]。IL-1β和IL-18主要由单核-巨噬细胞及中性粒细胞分泌，能够诱导其他炎性因子的释放而介导炎症级联反应的扩大，诱导T2DM的慢性微炎症状态过程[16]。IL-6也是重要的促炎细胞因子，其与IL-1均可诱导初始CD4+T细胞专项Th17细胞分化，参与胰岛β细胞的自身免疫反应过程[17]。IL-17A则可促进IL-1β、TNF-α等的分泌，并可诱导一氧化氮合酶(NOS)及自由基的生成，从而加重胰岛β细胞损伤，诱导细胞凋亡[18]。IL-23参与机体抗肿瘤免疫、抗感染免疫和多种自身免疫性疾病的发生及发展，作为一种前炎性因子，其可作用于炎症性巨噬细胞、记忆性T细胞及NK细胞等而诱导IL-18等多种炎症因子的生成，直接或间接损伤胰岛β细胞[19]。本研究结果显示，两组治疗前血清炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-18、IL-23)及PBMCs中NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)mRNA表达量均处于较高水平，认为NLRP3炎性体及多种促炎因子在T2DM的发生及发展中发挥着某种作用。王仙凤等[20]研究亦显示，T2DM患者的NLRP3炎性体表达明显升高，在合并DM组患者中升高尤为明显，且随着病情加重呈显著升高趋势，这与本研究结论相符。本研究患者经相应治疗后上述指标均获得明显降低，而观察组明显低于对照组同期(P<0.05)，认为沙格列汀联合二甲双胍可能抑制NLRP3炎性体活化及相关促炎因子的释放而发挥治疗作用。

综上所述，沙格列汀联合二甲双胍治疗老年T2DM安全有效，能够更好地改善胰岛β细胞功能、减轻胰岛素抵抗、提高血糖控制效果，其机制可能与抑制炎性因子及NLRP3炎性体活mRNA表达有关。但本研究样本尚小且观察指标有限，其具体机制仍有待进一步深入研究。